王 可，吴意红 ,刘顺治，范世明，丘鹰昆*

(1.厦门大学药学院福建省药物新靶点研究重点实验室，福建 厦门 361105；2.福建中医药大学，福建 福州 350122)

桑科植物资源丰富，有构属(Broussonetia)、桑属(Morus)、榕属(Ficus)等，我国共 11 属 150 余种[1]。研究发现榕属植物具有降血糖、镇痛抗炎、抗菌、提高免疫等功效[2]。粗叶榕(Ficus hirta)、天仙果(F.erectavar.beecheyana)、薜荔(F.pumila)、变叶榕(F.variolosa)常作为闽南地区药食同源的药材，粗叶榕根能治疗肺痨咳嗽、脾虚浮肿、风湿痹痛，具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用[3]；天仙果根有祛风除湿的功效[4]；薜荔叶具有祛风除湿、活血通络、消肿解毒等功效[5]；变叶榕根具有祛风除湿、活血止痛、催乳的功能[6]。这四种植物在闽南地区分布广泛，《福建药物志》中亦记载其药用功效。

斑马鱼(Brachydanio rerio)具有繁殖能力强，胚胎发育迅速，胚胎透明、容易观察且与人类有高度相关性等优点[7]。目前，斑马鱼急性毒性实验的高通量筛选在国内外广泛应用。

本实验研究粗叶榕、天仙果、薜荔、变叶榕不同部位水提取物和醇提取物对斑马鱼胚胎的急性毒性，以期为闽南榕属汤料植物的安全应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

野生型AB 系斑马鱼，由厦门大学药学院李明玉实验室提供。

桑科榕属植物粗叶榕、天仙果、薜荔、变叶榕采自厦门市翔安区，经厦门大学药学院丘鹰昆副教授鉴定，标本保存于厦门大学药学院，标本号分别为 ：粗 叶 榕 (350213LY0120)、天 仙 果(350213LY0168)、薜荔(350213LY0123)、变叶榕(350213LY0107)。干燥粗叶榕、天仙果的根、茎、叶，薜荔茎、叶、果及变叶榕茎、叶，研磨成粗粉，保存备用。

1.2 仪器与试剂

全自动性光照培养箱(韶关市医疗器械有限公司，型号LRH-250-G)，莱卡体视显微镜(德国，型号M205)，Thermo 移液枪(赛默飞世尔科技有限公司，中国)，24 孔板(Cosmo 公司，美国)，DMSO(生物级，Sigma，美国)。

1.3 提取物制备

分别称取干燥的药材粉末，加入10 倍量超纯水，加热回流提取2 次，每次30 min，合并两次滤液，浓缩、干燥得到实验用水提取物。

醇提取物的制备方法同上，提取溶剂为95%乙醇(V/V)。

1.4 提取物溶液配制

水提取物、醇提取物分别用超纯水、生物级二甲基亚砜配制为200 mg·mL-1母液，用于斑马鱼胚胎急性毒性实验时，将母液稀释至终浓度200 μg·mL-1、100 μg·mL-1，保存于4 ℃冰箱备用。

1.5 急性毒性实验

采用静水实验法[8]，以受精后5 d 为一个实验周期，取受精后1 d 发育健康的斑马鱼胚胎，置于24孔板中，每孔20 个左右胚胎，用滴管将孔中的水移去，分别暴露于不同浓度的水提取物和醇提取物中，每孔1.5 mL 溶液，同时以斑马鱼培养液作为空白对照组。每天挑出死亡的幼鱼，记录鱼死亡数量，并拍照，连续观察4 d。

2 结果与分析

2.1 含水率与提取物得率

粗叶榕、天仙果、薜荔、变叶榕不同部位干燥样品水提物、醇提取物的得率如表1 所示，天仙果和变叶榕不同部位的水提取物、醇提取物的得率差异较大。

表1 四种榕属植物不同部位的干燥样品水提物、醇提取物得率(%)Table 1 The yields of aqueous extracts and alcohol extracts of dried samples from different parts of four Ficus plants (%)

2.2 四种榕属植物不同部位水提取物的急性毒性

粗叶榕、天仙果、薜荔、变叶榕不同部位水提物急性毒性实验，给药200 μg·mL-1，48 h 时，胚胎发育正常，与空白组相比，榕属汤料植物的主要药用部位水提取物能加速斑马鱼胚胎发育，并显著提高胚胎存活率(图1)。给药96 h 后，与空白组对照相比，除天仙果茎水提取物组死亡率接近空白组外，其余处理组的斑马鱼胚胎死亡数量明显低于空白组，表明其水提物增加了斑马鱼胚胎的存活率(图2:A)，体视显微镜观察表明，上述提取物对胚胎生长没有负面影响，未表现出畸形等毒理学病变(图2:B,C)，说明这四种汤料植物有利于提高斑马鱼的存活率，且未表现出急性毒性(图2:C)。

图1 榕属不同药用部位水提取物给药200 μg·mL-1 斑马鱼胚胎48 h 死亡情况Fig.1 Mortality of zebrafish embryos after 48 h treated with aqueous extracts of different medicinal parts of Ficus spp.(dosage 200 μg·mL-1)

2.3 四种榕属植物不同部位醇提取物的急性毒性

粗叶榕、天仙果、薜荔、变叶榕不同部位醇提物，给药200 μg·mL-1，96 h 后斑马鱼死亡率均低于35%(图3:A)，与空白组无明显差异。在实验中还发现，部分醇提取物在试验周期最后2 d，出现斑马鱼胚胎畸形加剧的情况，可能由于给药3～4 d 后发生累积毒性效应，导致急性毒性效应。体视显微镜下观察显示，天仙果茎、叶及变叶榕叶醇提物处理的斑马鱼出现尾部畸形(图3:B,C,E)；薜荔叶、果醇提取物处理出现明显心包水肿(图3:F)，说明上述醇提取物在高浓度下对斑马鱼胚胎心脏和脊柱发育有影响，可能是肝毒性、肾毒性、心脏毒性的综合表现。

图3 榕属不同药用部位醇提取物处理96 h 斑马鱼胚胎死亡率及形态Fig.3 Mortality and morphology of zebrafish embryos after 96 h treated with alcohol extracts from different medicinal parts of Ficus spp.

3 讨论

粗叶榕、天仙果、薜荔、变叶榕在闽南地区常作为凉茶、佐料配伍水煮饮用，具有一定的药用价值。斑马鱼基因与人类基因相似度高达87%，是毒理学评价中的重要动物模型。为进一步了解闽南常见榕属汤料植物的急性毒性，作者进行了斑马鱼急性毒性模型实验，结果表明榕属(粗叶榕根、天仙果根、叶，薜荔果，变叶榕茎、叶)不同药用部位水提取物对斑马鱼的LC50均大于200 μg·mL-1。根据鱼类急性毒性分级标准(GB/T21281-2207)，LC50≤1 mg·L-1为极高毒；LC501～10 mg·L-1为高毒；LC5010～100 mg·L-1为中毒；LC50＞100 mg·L-1为低毒。可见，粗叶榕、天仙果、薜荔、变叶榕不同部位水提取物、醇提物是低毒至无毒的。但其中部分醇提取物在高浓度时对斑马鱼胚胎表现出发育毒性，斑马鱼出现尾部畸形、心包水肿等现象，需要进一步对其毒性成分进行分析。目前从桑科榕属植物中分离得到的化合物有三萜化合物、黄酮类化合物、倍半萜、香豆素、生物碱、甾醇等[9—10]，其中佛手柑内酯等香豆素成分具有细胞毒性，该类成分脂溶性较强，在较高的剂量下可能与毒性效应有关[11—13]。

此外，上述植物水提取物及天仙果、粗叶榕的醇提取物能促进胚胎生长，提高斑马鱼存活率，其有益功效的物质基础值得深入研究；而部分醇提取物在高浓度条件下表现出一定的胚胎毒性，但对胚胎存活率未产生显著影响。粗叶榕、天仙果、薜荔、变叶榕作为汤料应用，其毒性低，安全性高，上述植物较少用作药酒原料，但也应当考虑醇提取物在较高摄入量情况下可能导致的毒性效应。值得注意的是，传统应用所选取的药用部位，如粗叶榕根、天仙果根、变叶榕根、薜荔茎，在实验中均未表现出不良毒性效应，说明其药用部位选材的合理性，在实际应用中应注意参考。综上，本实验为闽南常见桑科榕属汤料植物的使用提供安全性评价依据。