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(1.浙江工商大学海洋食品研究院,浙江杭州 310012;2.浙江省水产质量检测中心,浙江杭州 310023)

脂质是生命机体重要的有机化合物,其不溶于水但易溶解于氯仿、醇、醚等非极性有机溶剂。细胞中的脂质分子大致可分为3 大类,包括极性脂质(糖脂类、鞘脂类和磷脂类)、非极性脂质(胆固醇、胆固醇酯和甘油三酯)还有脂质代谢物(脂质合成或分解反应的产物)[1]。脂质在生命系统中起到多种作用:脂质构成双分子层结构使细胞成为整个生命机体中的子单元,相对独立于外部环境;脂质作为疏水介质,提供了实现膜蛋白的功能并与其相互作用的场所;各脂质分子通过酶反应产生第二信使[2]。

脂质组学是继基因组学、蛋白质组学、代谢组学后迅速发展的“组学”学科,主要研究脂质参与蛋白质表达和基因调控等过程中的功能、分析脂质在生物体内其结构与代谢途径、以及研究脂质在生物代谢、免疫等过程中所起到的作用等三大方面[3]。脂质组学在给定的生物系统中对脂质进行分子结构鉴定和成分定量,并试图阐明单个脂质分子是如何影响脂质代谢和整个系统的功能[4]。脂质代谢在多种与脂质相关的疾病(糖尿病、肥胖症和阿尔茨海默症等)研究中起着至关重要的作用,因此脂质组学相关研究得到了越来越广泛的关注。同时,得益于色谱和质谱技术的快速发展,脂质组学的研究领域也迅速扩张[5],目前已经被应用于包括水产品研究在内的诸多学科和领域。

随着海洋经济,尤其是水产品行业的发展,近年来人们对其发展也更加重视,脂质组学在水产品方向的研究应用也日益展开。水产品种类繁多,资源广泛,目前人们对水产品的消费量和传统的牲畜相比还有很大差距,但随着人们消费水平以及消费观念的改变,水产品的市场需求量正迅速提升,这也带动了水产品行业的发展,因此对水产品进行更加深入的了解势在必行。脂质组学这一研究方法为水产品的研究提供了新的思路,使得人们对水产品的研究向更加多元化的方向发展。然而由于水产脂质组学相对起步较晚,目前有关水产脂质组学的研究还正在探索当中。很多检测技术以及分析方法尚且处在初步探索阶段,随着日后的研究发展,可以建立起一套完整的水产品脂质图谱,本文从多个方面介绍了水产脂质组学的发展与应用,为水产品鉴定、污染监测、疾病预防等方面未来发展提供科学依据以及技术支持。

1 水产品脂质提取方法

随着最早Folch提出的氯仿-甲醇体系以来,通过不断改进优化提取效率和降低毒害性,现已研究衍生出多种脂质提取方法,可针对不同种类的脂质分子极性采取不同技术手段。水产品具有水分含量高,脂质及小分子代谢物杂质少的特点。目前用于水产品中脂质提取主要有氯仿-甲醇体系、甲基叔丁基醚体系、乙醇溶剂体系、超临界流体萃取、固相萃取等方法。

1.1 氯仿-甲醇体系

氯仿-甲醇法对游离脂和结合脂的提取非常有效,通过此方法可获得较为纯净的脂质提取物,且提取效率高,在广义的生命科学领域得到了广泛应用[5]。Folch等[6]首先提出了以氯仿与甲醇配比为2∶1的混合溶液对动物组织中的脂质进行提取的方法。在此基础上,Bligh[7]改变了氯仿-甲醇-水的配比,对鳕鱼组织中的脂质进行提取,其最终脂质得率提高了53.7%。王少梅等[8]研究探讨了简化氯仿-甲醇法的提取步骤对提取效果的影响,通过对鱼体脂肪的提取和含量测定,结果表明试验过程中可以省去20 h的样品匀浆步骤,取而代之以样品在氯仿-甲醇溶液中浸泡2 h以上。尽管经过多年的技术更迭,氯仿-甲醇体系依然是最为经典的脂质提取方法之一。然而氯仿-甲醇法使用了毒性较强的氯仿溶剂,因此本方法仅适用于样品检测分析,无法应用于食用性脂质的产业化提取。

1.2 甲基叔丁基醚体系

由于传统方法中使用的氯仿溶剂对人体和环境的毒性相对较高,科研人员致力于寻找高效、友好的替代溶剂。甲基叔丁基醚(Methyl tertlary butyl ether,MTBE)是一种具有高辛烷值的无色透明溶剂,具有非腐蚀性和化学稳定性,不仅对人体健康威胁小,且在储存过程中不形成过氧化物,因此不存在降解不稳定的脂类的风险。MTBE法的具体实验步骤与氯仿-甲醇法类似[9-10],Matyash等[11]用MTBE法对水产品中常见微生物大肠杆菌中脂质进行了提取,证明了MTBE法可以更高效、更清洁地萃取回收脂质。MTBE法与氯仿-甲醇法的主要差别在于MTBE的混合样品体系离心后,由于MTBE的密度低,在相分离过程中,含有脂质的有机相形成上层,进而简化了收集过程,更有利于实验人员移取样品提取物。

1.3 乙醇溶剂体系

尽管氯仿-甲醇体系和MTBE体系具有较高的脂质提取效率,然而所涉及的溶剂均非食品加工助剂之列,因此并不适用于食品工业的应用。乙醇的生产技术成熟,具备良好的可再生性和安全性。Undeland等[12]向鲱鱼组织中先后加入SDS和乙醇,通过漩涡搅拌使蛋白质沉淀,后加入等体积正庚烷均质并离心,分离得到含有鲱鱼脂质的有机相。陈丽丽等[13]比较了酶水解-乙醇法、乙醇-正己烷分提法、以及氯仿甲醇法三种方法对淡水鱼卵中的脂质和磷脂的提取效率,优化改进了酶水解-乙醇提取技术,采用0 ℃的乙醇,并对样品均质后再加入等体积的水,使得样品与水结合更加均匀。郭休玉等[14]基于乙醇为溶剂研究出将磷虾油的提取应用于工业化生产的方法,通过两步提取法使虾油提取率达到15.72%。目前乙醇溶剂体系已成功应用于富含磷脂的南极磷虾油工业化提取中。

1.4 超临界流体萃取

超临界流体萃取(Supercritical fluid extraction,SFE)是近些年被广泛使用的一种新型分离提取技术,它依据不同化合物在超临界流体中的溶解度差异,改变体系的温度和压力,从而实现不同样品脂质的提取,同时萃取剂可分离回收并重新压缩,最大程度节约资源[15-16]。包宗宏等[17]利用CO2-SFE对鱼油中的二十碳五烯酸(Eicosapentaennoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(Ducosahexenoic acid,DHA)进行提取,同时对比了Rizvi[18]、Bharath[19]和Nilsson[20]等人利用SC-CO2对鱼油脂肪酸的实验研究,总结出在低温条件下,选择合适的萃取压力,并引入夹带剂,不饱和程度越高的脂肪酸,其在SC-CO2中的溶解度越高,从而萃取率也就越高。许艳萍等[21]采用CO2-SFE萃取大黄鱼鱼卵中的油脂,通过正交实验分析出最佳萃取时间、温度和压力,在此条件下萃取率可达86.12%,其中EPA和DHA之和达到19.40%,提高了大黄鱼副产物的综合利用率,丰富了海洋鱼油的制备来源。超临界流体萃取技术以其提取速率高、选择性强、无毒无溶剂等优点,已被运用于脂质物料的分离提取当中。

1.5 固相萃取

固相萃取(Solid phase extraction,SPE)利用样品中存在的不同化合物与吸附剂之间的相互作用力不同,使得目标化合物同样品中的杂质分离,并经过洗脱液的冲刷快速洗脱,从而分离提纯该目标化合物。根据所需萃取物的不同以及吸附剂的不同,目前使用较多的固相萃取技术有固相微萃取技术、磁力搅拌棒吸附萃取、以及分子印迹固相萃取技术等。沈清等[22]以乌鳢作为样本,利用氯仿-甲醇法得到其肌肉组织中的脂质粗提物,随后讨论了不同上样量、pH、洗脱液浓度以及SPE填装料对固相萃取的影响,通过对磷脂中甘油磷脂中的磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine,PC)和磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol,PI)回收率的测定从而确定了固相萃取乌鳢肌肉组织中磷脂的最适条件,100 μL的上样量,pH为2,50%的乙腈溶液1 mL作为洗脱剂,从而对磷脂进行了纯化。固相萃取法不需进行相分离,实际操作简便、节约有机溶剂、提取率高并且可以对微量样品进行处理。

2 脂质组学检测技术

脂质组学的概念由Han等[23]于2003年首次提出。尽管脂质组学起步较晚,通过借鉴蛋白质组学、代谢组学的经验和质谱等精密设备的发展,脂质组学技术在近几年被广泛重视并发展迅速,朝着更加准确多元的方向不断改进。目前已经建立多种适用于脂质分子定性和定量的方法,如直接进样的鸟枪法、精确定量的液质联用法等,在试验中可根据实验材料及内容合理选择检测技术或者多种技术联用。

2.1 鸟枪法

鸟枪法在脂质组学研究中应用广泛,根据脂质的理化性质并加以利用,使脂质组的高通量分析更为快捷高效[24]。其步骤是将细胞或组织的总脂质提取物通过针泵直接注入串联质谱仪中,通过准确测定脂质分子质量或从相应母离子中获取MS2谱来识别单个分子结构。通过调节溶剂组成(有机相比例、pH、缓冲液浓度)和电离条件(极性模式、电压能量、雾化温度等)可使检测灵敏度提高几个数量级[25]。Han等[26]应用鸟枪法对脂质提取物中脑苷脂分子进行了ESI-MS检测和MS/MS结构鉴定,随后对脑苷脂分子进行定量分析。随后采用多维质谱分析的鸟枪法脂质组学,确定了800多种脂类分子的水平。崔益玮等[27]将水产加工副产物中提取的脂质样品经流动注射直接进样,通过母离子扫描(Precursor ion scan,PreIS)和中性质量丢失扫描(Neutral loss scan,NLS)实现不同磷脂分子在离子源内的分离鉴定和半定量。鸟枪法在电喷雾电离质谱(Electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)技术基础上进行了改进,根据脂类特征官能团碎片特征,使多种脂类在一次分析中平行测定。

2.2 液相色谱质谱联用法

液相色谱质谱联用(Liquid chromatography mass spectrometry,LC-MS)利用了液相色谱和质谱两者的优势,在对复杂样品各组分进行有效分离的同时还可进行程序化结构测定,实现准确定性与定量分析。根据脂质种类的不同如磷脂类、胆固醇类等，分别利用不同的离子峰提取法(XIC)进行提取,并且基于一系列的固定相的使用,根据各脂质分子之间存在的极性差异以及不同洗脱液的洗脱作用,对同种脂质的不同组分如PC、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidyl ethanolamine,PE)、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)以及PI等进行分离。Shen等[28]使用亲水色谱飞行时间质谱(HILIC-QTOF/MS)先后分离洗脱海马提取物中磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol,PG)、磷脂酸(Phosphatidic acid,PA)、PC、PE、PS、PI等磷脂,并利用质谱源内分离各类磷脂中的不同分子。崔益玮等[29]利用乙醇浸提法制备得到虾头废弃物中的磷脂,并用HPLC-MS技术经负离子模式扫描实现磷脂分子的分离鉴定和定量分析,成功鉴定磷脂碳链中的棕榈酸、亚油酸、二十碳五烯酸和硬脂酸等23 种脂肪酸链结构。液相色谱质谱联用法速度快、灵明度高,并且样品的前处理过程与分析更加简单。

2.3 基质辅助激光解吸质谱法

基质辅助激光解吸离子化(Matrix assisted laser desorption ionization,MALDI)质谱最早应用于蛋白质核酸分析领域[30-32]。随着该技术的不断发展,样品与基质可在单一的有机相中形成均匀的基质/分析物混合物,奠定了将MALDI技术应用于脂质组学的基础。Schiller等[33]利用氯仿甲醇法提取脂质,以2,5-二羟基苯甲酸为基质与脂质共结晶,应用MALDI-TOF-MS技术对氯仿层中的二酰基甘油、PC和PI等不同种类脂质分析检测。李国琛[34]通过Folch法对在含镉水体中不同养殖时间下的鲫鱼肉进行磷脂的粗提,随后采用HPLC将磷脂粗提物中的PC分离纯化并进行MALDI-TOF-MS分析,研究了水体中镉对鲫鱼的毒害作用。沈清等[35]采用正离子模式对三文鱼样品中的磷脂提取物进行MALDI离子化分析并进行了方法学验证,成功对三文鱼肌肉组织中28种磷脂分子作出了鉴定。MALDI技术在脂质分析中其最大的优势在于脂质样品与常规基质极易共溶于有机溶剂,使得样品与基体化合物混合物的结晶均匀性极大的提高,从而获得良好的质谱分辨率。基于MALDI电离的飞行时间质谱法(Time of flight mass spectrometry,TOF-MS)拥有极高的灵敏度,可直接研究水产品细胞膜上的生物功能相关脂质混合物。

2.4 核磁共振技术

图1 快速蒸发离子化质谱鉴定三文鱼和虹鳟鱼[42]Fig.1 Discrimination of salmon and rainbow trout by rapid evaporative ionization mass spectrometry[42]

核磁共振波谱法(Nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)利用自旋原子核在外磁场作用下的核自旋能级跃迁所产生的吸收电磁波谱来鉴定有机化合物结构。在不进行任何化学修饰的情况下,利用高分辨率质子核磁共振波谱可分析获得全脂提取物及其完整组分的完整信息。Sparling等[36]建立了一种基于高场质子核磁共振光谱的细胞膜脂质快速分析方法,其利用标准脂质特征共振数据库,成功对脂质混合物的谱峰结构鉴定。Adosraku等[37]采用高效液相色谱法对油脂提取物进行分离,然后采用一维和二维高分辨NMR对细胞膜中提取的脂质进行定量和定性分析,确定了各脂类成分的脂质特征,并且比较了各主要甘油磷脂的脂肪酸类型和组成。NMR作为一种高效的无损检测技术,在水产品中脂质结构鉴定和含量测定中得到了广泛的应用,是水产品脂质组学研究重要的技术手段。

2.5 其他检测技术

随着脂质组学的研究日益发展,脂质组学的检测方法也日趋多元化。除了上述涉及的四种方法外,主要还有薄层色谱(Thin-layer chromatography,TLC)、气相色谱质谱联用(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、毛细管电泳质谱联用(Capillary electrophoresis with mass spectrometry,CE-MS)、ESI-MS、快速蒸发离子化质谱等检测技术[38]。TLC是最早应用与脂质分析的一种方法,这种方法快速且经济,具有较好的分离效率,但是TLC存在灵敏度和分辨率都比较低,而且样品的制备步骤复杂,对样品量需求较大,实验操作中还容易导致不饱和脂类氧化，结构改变。Müthing[39]利用TLC对糖鞘脂类的结构与种类识别做出分析。GC-MS的灵敏度相对薄层色谱法有了显著提高。Zelles[40]运用GC-MS对脂肪酸进行了定量分析。CE-MS是一种分离能力又高且灵敏度又好的方法,可很好的应用于分离检测脂质等生物大分子。Hübner[41]利用CE-MS对脂多糖和脂质A进行分离并定量分析。Song等[42]以脂质组学为基础,建立了基于快速蒸发离子化质谱的三文鱼和虹鳟鱼鉴别技术(图1),该方法无需样品前处理,鉴定结果可实时显示身份识别率。基于脂质组学的水产品检测技术日新月异,整体朝着更精确、灵敏、便捷的方向不断有新的突破。

3 脂质组学在水产研究的应用

3.1 水产脂质轮廓分析

水产品种类众多,且体内脂质成分多样,但由于物种不同,其生物体内脂质的含量与种类也存在着差异。目前国内对于水产品脂质组学的研究与利用还未成熟,水产品脂质组学研究尚处于刚刚起步的状态。利用脂质组学对水产品的脂质进行定性定量分析,从而可以对其脂质轮廓做出总结与统计。劳邦盛等[43]利用氯仿-甲醇法对5种贝类进行脂质的提取,随后利用气相色谱质谱联用对提取的脂肪酸进行了定性分析,测定了其脂肪酸含量。为日后研究提供了科学依据。刘艳青等[44]利用气相色谱法对皱纹盘鲍内脏的脂质成分进行分析,结果表明其脂质含量丰富并且大多为不饱和脂肪酸,验证了人们对其营养丰富的认知。多不饱和脂肪酸可降低人体心脑血管疾病,Bandarra等[45]通过氯仿-甲醇法对不同季节的沙丁鱼进行脂质提取,采用薄层色谱技术对脂类进行定性和定量分析,发现在5月份沙丁鱼体内多不饱和脂肪酸的含量最多,为人工养殖及打捞提供了优化建议,保证了食用沙丁鱼的营养水平。通过水产品脂质组学轮廓研究,可以得到各类水产品的脂质信息,从而为其进一步分析利用提供数据基础。

3.2 品种鉴定和标记物研究

水产品体内脂质成分与含量主要受自身种系、摄食环境等因素的影响,因而理论上利用脂质组学技术可实现水产品种类的区分和产地的溯源。同时由于脂质的普遍存在和化学稳定性,长期以来已经成功的作为分子标记物用于评估有机物在自然环境中的来源和命运,可以准确及时的得到生物体的反馈,做出生物标记物的筛查。Shen等[46]对鲫鱼、草鱼、鲈鱼组织中的磷脂进行提取,采用鸟枪法对比了三者之间磷脂成分的主要差异,从而可以利用磷脂标记物对三种鱼肉进行鉴别,为脂质标记物研究提供了新的方法。随后其团队[47]针对不同产地的海马药材误标现象,采用HILIC-MS/MS技术研究海马脂质组学指纹图谱,比较了海马品种的脂质差异,正确认识了不同产地的海马。Pisani等[48]将脂质生物标记物分析应用于尼日尔三角洲东南部地区河口的表层沉积物中的细菌藻类等海洋资源,定量测定了脂族脂类短链正构烷烃(

3.3 水产代谢与养殖

脂质组学通过对生物体内脂质的结构以及其在生物代谢过程作用的研究,了解脂质在生物体生长代谢中所起到的作用,对不同脂质的不同作用做出探讨,从而对某些生物活动以及功能作出解释。赵磊等[49]以植物油代替鱼油作为为饲料对河蟹进行喂养,采用气相色谱法对河蟹脂质代谢水平进行了测定,并对河蟹的抗氧化性和免疫性进行研究,了解了不同饲料所带来的影响,讨论了植物油鱼油混合饲料的最佳配比。Li等[50]采用气相色谱法配合火焰电离检测器(Flame ionization detector,FID)对俄罗斯鲟鱼体内脂质进行分析,讨论了六种不同的饲料对其脂质代谢、生长性与抗氧化性的影响,为饲料的选择提供了依据。随后其团队[51]以共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)代替鱼油对日本沼虾进行喂养,采用索氏抽提法对脂质进行粗提,然后利用气相色谱法对其脂肪酸进行分析,得到CLA对于日本沼虾脂质代谢的影响。通过脂质组学技术研究水产养殖过程中饲料、气候、环境等不同因素对生物脂质代谢的影响,针对代谢规律优化养殖模式,进而可以提高水产品质和养殖密度。

3.4 水产品加工与贮藏

脂质组学在水产品加工与贮藏方向的研究主要包括水产品脂质成分与加工特性,加工过程中脂质变化对食品理化及生物性质的影响,贮藏过程中脂质的氧化与降解现象等。崔益玮等[52]将鱼类内脏进行二次加工制备得到了鱼油和磷脂粗提物,通过气相色谱和鸟枪法鉴定脂质分子,并以脂质氧化为指标优化了加工工艺,借助脂质组学手段实现了副产物的综合利用。王昕岑[53]利用直接进样电喷雾串联质谱法对不同贮藏温度下的太平洋鳕鱼、南美白对虾、褶牡蛎的磷脂进行了定性与定量分析,结果表明在较低温度(如-20 ℃)下,三种水产品的磷脂性质几乎不发生改变,而在4 ℃时,由于磷脂酶的催化使得磷脂发生降解,故表明了低温冻藏更加适合于三种水产品的贮藏。Wang等[54]通过鸟枪法脂质组学研究了不同贮藏期的草鱼肌肉组织中磷脂变化,揭示了不同阶段微生物对磷脂氧化与降解规律。脂质组学的运用可以为水产品的加工提供更加科学有效的方法,降低水产品在运输贮藏方面的损耗,保证产品质量。

3.5 水产品功能与营养

由于水产品脂质含量丰富,了解脂质在疾病的产生以及治疗等方面的作用,从而对疾病对生物体的危害做出预测,在疾病的诊断、新药的研发、疾病的治疗等方面脂质组学都可发挥重大作用,例如水产品中大量不饱和脂肪酸对预防人类心血管疾病等方面有着重要作用。Lankinen等[55]通过脂质组学技术研究了高脂鱼类摄入对人体中胰岛素抵抗和炎症相关脂质水平的影响,结果证明脂质是诱导胰岛素抵抗和炎症的潜在介质,食用高脂鱼类对动脉粥样硬化性血管疾病发展有一定的保护作用。Stanley等[56]通过对多名参与者进行特定的鱼油补充,运用DI-MS、LC-MS/MS等脂质组学分析方法,对12 个月后人体内EPA和DHA等脂质含量进行测定并与未补充鱼油时对比,评估了鱼油对于人体健康的影响,揭示了不饱和脂肪酸与人体肥胖程度的关系。通过脂质组学技术研究水产品中脂质的结构与性质,并使其应用于人类机体,调节人体代谢,可为人体补充所需营养素,优化饮食特膳。

4 结论

脂质组学作为代谢组学的一个重要分支,自其概念首次提出以来,通过借鉴蛋白质组学及基因组学研究的经验,以及科学家们不懈的努力,正一步步的变得更加科学、高效、实用。众多脂质提取分离方法与脂质组学检测技术的开发与改进也使得脂质组学的研究更加准确方便。水产品是食品科学中的一门重要分支,脂质组学的应用,逐步深入对水产品中脂质的分析,建立更加完善的研究方法,无疑会为水产品的代谢、加工、贮藏、营养等研究提供了更为有效的技术手段,为学科注入新的活力。水产品中的脂质种类众多,随着水产品脂质组学研究的不断深入,分别对其中各种脂质进行定性与定量分析,并且对其脂肪酸链结构以及各种酯化反应进行探究,建立完整的水产品脂质分析体系与数据库,定会使水产品相关研究以及水产行业走上一个新的高度。