樊艳叶,3,林日辉,*,杨 慧,周丽红4,曾艺君4,黄霞洁,蒋心濛

(1.广西民族大学化学化工学院,生物转化与过程反应重点实验室,广西南宁 530008;2.广西民族大学化学化工学院,广西多糖材料与改性重点实验室,广西南宁 530008;3.非粮生物质酶解国家重点实验室,广西南宁 530000;4.广西民族大学相思湖学院,广西南宁 530008)

木薯淀粉作为一种可再生的碳水化合物,在食品、药品、化妆品及燃料生产方面具有非常广阔的工业应用前景[1],但由于其本身存在冷水可溶性差、抗剪切能力差以及易老化等诸多不足,使得木薯淀粉的应用受到限制[2]。因此,迫切需要对木薯淀粉进行改性研究,使其具有独特的理化性能,以满足不同工业应用的需求。在目前众多的淀粉改性方法中,碱/醇法作为化学改性中的一种方法[3],由于其具有操作简单以及易于工业化生产等优势,一直受到广大研究者的关注[4]。如范聪聪等[5]研究了乙醇/碱法对颗粒状冷水可溶性荞麦淀粉溶解度的影响,发现温度对淀粉溶解度的影响最大,其次是碱的用量,并且获得最优条件下淀粉的最大溶解度为22.52%。Choi等[3]报道了乙醇和碱处理对马铃薯淀粉理化性能产生显著影响。本课题组前期在研究碱/乙醇处理对木薯淀粉去结晶化的影响中,获得了具有可控去结晶化的淀粉颗粒,并发现氢氧化钠浓度对淀粉可控去结晶化的影响最显著[6]。由此可见,碱/乙醇处理可显著影响淀粉的结构与性能。然而,目前对于利用碱/醇法对淀粉进行的改性研究,主要集中在利用氢氧化钠对淀粉进行处理,并且针对碱成分中OH-对淀粉分子内氢键影响来分析其对淀粉的作用机制[7-8],不同碱处理的差异及碱成分中金属离子对淀粉分子结构的影响迄今未见报道。

因此,本文将第IA主族碱金属氢氧化物溶解于90%乙醇中,配成不同类型的碱/醇溶液,对木薯淀粉进行处理,并通过偏振光显微镜、激光共聚焦显微镜、扫描电子显微镜、X-射线衍射分析、傅里叶变换红外光谱仪以及直链淀粉含量、还原糖含量分析等手段,系统研究不同碱对木薯淀粉颗粒形貌、结晶性质以及分子结构等的影响,为后续进一步探索新的淀粉改性方法及优化淀粉改性的工艺技术等研究提供思路和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

木薯淀粉 食品级,广西岑溪市三角淀粉有限责任公司;氢氧化锂、氢氧化铯(一水合物) 分析纯,上海麦克林生化科技有限公司;氢氧化钠、碘 分析纯,成都金山化学试剂有限公司;氢氧化钾、3,5-二硝基水杨酸(DNS)、结晶酚 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;氢氧化铷 分析纯,阿法埃莎(中国)化学有限公司;无水乙醇、溴化钾 分析纯,成都市科隆化学品有限公司;直链淀粉标准品、支链淀粉标准品 美国Sigma-Aldrich公司;二甲基亚砜(DMSO) 分析纯,天津市大茂化学试剂厂;碘化钾、酒石酸钾钠(四水)、无水亚硫酸钠、氰基硼氢化钠 分析纯,阿拉丁试剂(上海)有限公司;葡萄糖 分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;浓盐酸 分析纯,廉江市爱廉化试剂有限公司;8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐(APTS) 荧光级,阿拉丁试剂(上海)有限公司。

AL104型电子分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;SHB-III型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;30 mL平盖式反应釜 西安仪创实验室仪器设备有限公司;WGLL-65BE型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司;SUPRA 55 Sapphire型场发射扫描电子显微镜 德国卡尔蔡司公司;MiniFlex600型X射线衍射仪 日本理学公司;ML32型生物显微镜 广州市明美光电技术有限公司;MAGNA-1R550型傅里叶变换红外光谱仪 美国赛默飞世尔科技公司;85-2数显恒温磁力搅拌器 上海皓庄仪器有限公司;UV2300II型紫外可见分光光度计 上海天美科学仪器有限公司;Leica TCS SP8型激光共聚焦显微镜 德国徕卡微系统有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 碱/醇溶液处理木薯淀粉 准确称取1 g木薯淀粉置于反应釜中,加入15 mL浓度为0.2 mol/L碱溶液(氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铷以及氢氧化铯)，其中溶液采用90%乙醇溶液配制,于120 ℃电热鼓风干燥箱中反应4 h。待反应结束后,冷却至室温,真空抽滤取滤饼,用95%乙醇洗涤三次,置于电热鼓风干燥箱中(35±1) ℃,过夜烘干得处理淀粉样品供后续分析,每个反应条件设置3个平行。

1.2.2 扫描电子显微镜分析 用导电胶将处理前后的木薯淀粉样品固定到金属样品台上,在真空状态下喷铂20 min后,在2.00 kV的加速电压下放大2000倍观察样品的颗粒形貌[9]。

1.2.3 激光共聚焦显微镜分析 参照张奎亮等的方法[10],取10 mg处理前后的木薯淀粉样品，分别与新鲜配制的15 μL 10 mmol/L 8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐(8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt,APTS)醋酸溶液及15 μL 1 mol/L氰基硼氢化钠混合,于30 ℃反应15 h,用1 mL去离子水清洗5次,将淀粉颗粒悬浮于100 μL 50%甘油与水的混合液中,取一滴悬浮液进行激光共聚焦显微观察并拍照。所用荧光激发波长为488 nm。

1.2.4 偏振光显微镜分析 将处理前后的木薯淀粉样品均匀分散到无水乙醇中,取一滴分散液于载玻片上,盖上盖玻片,调节显微镜至偏振光状态,在400×的放大倍数下观察样品的双折射现象并拍照[11]。

1.2.5 X-射线衍射分析 实验条件:Cu(ka)射线,Ni片滤波,电压40 kV,电流15 mA,扫描范围2θ为4～60 °,扫描速率为8 °/min,扫描步长为0.02 °。并利用MDI Jade 6.0软件参照Shu等[12]的方法计算淀粉样品的相对结晶度。

1.2.6 红外光谱分析 利用溴化钾压片法将处理前后的木薯淀粉样品分别与溴化钾研磨压片,然后在扫描分辨率为4 cm-1、扫描次数为32次以及扫描波数范围为400～4000 cm-1的测试条件下进行红外光谱测定[13]。

1.2.7 直链淀粉含量测定 参照黄祖强的方法[14]对处理前后木薯淀粉中直链淀粉的含量进行测定。分别配制浓度为0.0235 mg/mL的直链和支链淀粉标准溶液,移取直链淀粉标准溶液0、1、3、5、7、9、10 mL到7支试管中,再分别移取相应体积的支链淀粉标准溶液到上述试管中,配制成总体积为10 mL的直/支链淀粉标准混合液,各加入20 μL 2%的碘液,混匀,用紫外可见分光光度计测定混合溶液在600 nm处的吸光度。以混合溶液中直链淀粉的质量X(mg)为横坐标,吸光度Y为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程:

Y=2.4851X+0.0469(R2=0.9995)

式(1)

图1 不同碱/醇溶液处理的木薯淀粉的扫描电镜图(2000×)Fig.1 SEM images of cassava starch treated with different alkali/alcohol solutions(2000×)注:a. 原木薯淀粉,b. 氢氧化锂醇溶液处理淀粉,c. 氢氧化钠醇溶液处理淀粉,d. 氢氧化钾醇溶液处理淀粉,e. 氢氧化铷醇溶液处理淀粉,f. 氢氧化铯醇溶液处理淀粉。

称取200.0 mg的淀粉样品,加入少量的90%二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO),加热搅拌溶解后定容至50 mL。移取2 mL溶液,用去离子水定容至250 mL,混匀后按照标准曲线的方法测定样品溶液吸光度。按式(1)计算直链淀粉的质量X,然后按式(2)计算样品中的直链淀粉含量(%):

式(2)

式中:m为淀粉样品的质量,mg。

1.2.8 还原糖的测定 参照《生物化学实验》中总糖与还原糖的测定(3,5-二硝基水杨酸法)方法对处理样品的沉淀与上清液中的还原糖进行测定[15],并略作修改。配制浓度为500 μg/mL的葡萄糖标准溶液,取6支试管,分别加入0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL葡萄糖标准溶液,再分别加入相应体积的蒸馏水到上述试管中至溶液总体积为0.5 mL,各加入0.5 mL的3,5-二硝基水杨酸(3,5-Dinitrosalicylic acid,DNS)试剂,加热冷却后各加入4 mL蒸馏水,摇匀,用紫外可见分光光度计测定混合溶液在540 nm处的吸光度。以葡萄糖含量X(μg)为横坐标,吸光度Y为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程:

Y=0.0033X-0.0334(R2=0.9948)

式(3)

分别称取原木薯淀粉以及处理样品沉淀各1 g,加入约30 mL蒸馏水后在磁力搅拌器上加热搅拌溶解,用0.5 mol/L HCl溶液调节其pH至中性,冷却后定容至50 mL容量瓶中,过滤;另分别取处理样品上清液15 mL,用0.5 mol/L HCl溶液调节其pH至中性。然后分别取样品沉淀滤液及上清液各2.5 mL,各加入2.5 mL DNS试剂混匀,沸水浴加热5 min后冷却至室温,直接测定样品液在540 nm处的吸光度。按式(3)分别计算样品中的沉淀液和上清液中的还原糖质量X1(μg)和X2(μg),然后按式(4)计算样品中总还原糖含量(%):

式(4)

式中:m为淀粉样品的质量,g。

1.3 数据处理

每个处理重复3次,并采用 Origin 9.0 以及Excel 2010统计软件对相应的实验数据进行处理,并利用SPSS 24软件对数据进行邓肯式显著性差异分析。所有数据均表示为:平均值±标准偏差。

2 结果与分析

2.1 碱/醇处理对木薯淀粉颗粒形貌的影响

不同碱/醇溶液处理前后对木薯淀粉颗粒形貌影响的电镜分析结果如图1所示。可见,原木薯淀粉是具有截头末端且表面光滑的圆形,这与Campanha等[16]和Sangseethong等[17]观察到的结果类似;经过不同的碱/醇溶液处理后,所有木薯淀粉仍保持颗粒的完整性,形貌也未发生显著变化。说明在90%乙醇中,0.2 mol/L的碱处理不足以破坏淀粉的颗粒形貌,这与Zhu等[18]报道的高浓度乙醇可有效抑制淀粉的过度膨胀相类似。因为根据秦海丽等[8]的报道,在碱/醇溶液处理淀粉过程中,碱/醇的作用是相互制衡的。碱的作用趋向于促进淀粉分子羟基上的质子发生解离,使得淀粉分子带负电,使之相互排斥,从而促进颗粒溶胀,随着碱浓度的增大,作用力增强,最终导致淀粉结晶结构被打破,结晶序列发生变化。但淀粉颗粒周围存在的乙醇,可以抑制淀粉颗粒的吸水溶胀,维持颗粒的结构与形貌[8]。

2.2 碱/醇处理对木薯淀粉激光共聚焦显微的影响

图2 不同碱/醇溶液处理的木薯淀粉的激光共聚焦显微镜图(630×)Fig.2 CLSM of cassava starch treated with different alkali/alcohol solutions(630×)注:a. 原木薯淀粉,b. 氢氧化锂醇溶液处理淀粉,c. 氢氧化钠醇溶液处理淀粉,d. 氢氧化钾醇溶液处理淀粉,e. 氢氧化铷醇溶液处理淀粉,f. 氢氧化铯醇溶液处理淀粉。

图3 不同碱/醇溶液处理的木薯淀粉的偏振光显微镜图(400×)Fig.3 Polarized light micrographs of cassava starch treated with different alkali/alcohol solutions(400×)注:a. 原木薯淀粉,b. 氢氧化锂醇溶液处理淀粉,c. 氢氧化钠醇溶液处理淀粉,d. 氢氧化钾醇溶液处理淀粉,e. 氢氧化铷醇溶液处理淀粉,f. 氢氧化铯醇溶液处理淀粉。

木薯淀粉经不同碱/醇溶液处理前后的激光共聚焦显微结果如图2所示。由图2可知,原木薯淀粉的内部有一个黑点,即为淀粉的脐点,而在脐点处可观察到有空腔,空腔四周有轻微的裂缝,这与Huber等[19]对玉米和高粱淀粉的观察结果相似。此外,有少量淀粉颗粒还可观察到明暗相间的环层结构,根据陈佩等[20]的报道,此结构即为淀粉颗粒中由结晶层与无定形层交替形成的生长环。经过碱/醇溶液处理后,淀粉颗粒内部空腔处的裂缝均有不同程度扩大。陈佩[21]在利用酸处理淀粉时也发现,淀粉颗粒内部裂缝变宽且数量增多现象,其原因是酸渗透到淀粉的内部,并于脐点周围由内向外破坏淀粉的结构。可见,碱/醇液也可以渗透到木薯淀粉的内部,产生类似酸处理的结果。结合扫描电镜的观察结果可知,碱/醇溶液处理对木薯淀粉的去结晶化作用主要始于颗粒内部,而非颗粒表面。此外,不同碱金属氢氧化物对木薯淀粉颗粒内部裂缝的影响表现出从氢氧化锂到氢氧化铯(a～f)逐渐增大的趋势。其中氢氧化铯处理的样品的裂缝变化最大,裂缝变宽且数量增多,有些裂缝甚至穿过整个淀粉颗粒。而氢氧化锂和氢氧化钠处理样品裂缝的变化则相对较少,且大部分裂缝的长度相对较短。

2.3 碱/醇处理对木薯淀粉双折射现象的影响

木薯淀粉经不同碱/醇溶液处理前后的双折射现象如图3所示。由图3可知,原木薯淀粉具有明显的偏光十字,而经过不同碱/醇溶液处理后,样品的偏光十字并没有消失,且并未发现不同碱/醇溶液处理样品间的偏光十字有明显差异。根据莫芳等[2]的报道,在偏振光下可观察到淀粉的双折射现象,是因为淀粉颗粒内部分子链有序排列的结晶区和无序排列的无定形区在密度和折射率上存在差异。而结合激光共聚焦显微镜观察结果,可推测在实验条件下,不同碱/醇液处理虽然对淀粉颗粒内部产生影响,但这种影响尚不足以完全消除淀粉内部的结晶区与无定形区间的差异,因此淀粉的双折射现象仍得以维持。

2.4 碱/醇处理对木薯淀粉结晶结构的影响

木薯淀粉经不同碱/醇溶液处理前后的X射线衍射如图4所示。原淀粉在2θ为15、17、18以及23°附近有明显的衍射尖峰,其晶型属于A型[22-23]。经过氢氧化钾、氢氧化铷、氢氧化铯醇溶液处理的样品,在2θ为18 °附近的衍射峰消失,说明这三组处理在一定程度上改变了淀粉的晶型;而氢氧化锂和氢氧化钠醇溶液处理的样品衍射峰位置与原淀粉相比无显著变化,晶型维持为A型。从衍射峰强度分析,淀粉经不同碱/醇溶液处理后,衍射强度均比原淀粉有不同程度降低。其中,氢氧化铯处理的样品,其衍射峰均变为较为平缓的馒头峰,衍射强度最低;其余处理样品衍射峰强度由弱至强顺序分别为由氢氧化铷、氢氧化钾、氢氧化钠及氢氧化锂醇溶液。这可能是因为不同碱金属离子与淀粉分子链上的基团产生不同强度的静电作用,从而改变淀粉分子链原有的有序排列。可见,在氢氧根浓度一致的基础上,由第IA主族不同碱金属氢氧化物组成的碱/醇溶液对木薯淀粉进行去结晶化处理,样品的晶型、相对结晶度(表1)均有显著(P<0.05)区别。这表明碱金属离子在淀粉去结晶化过程中参与了影响淀粉结构变化的相关反应,为此,实验采用红外光谱分析方法,以进一步了解碱/醇溶液对木薯淀粉进行去结晶化处理过程中是否产生新的共价键或基团。

图4 不同碱/醇溶液处理的木薯淀粉的X射线衍射图Fig.4 X-ray diffraction patterns of cassava starch treated with different alkali/alcohol solutions

表1 不同碱/醇溶液处理的木薯淀粉的相对结晶度Table 1 Relative crystallinity of cassava starch treated with different alkali/alcohol solutions

2.5 碱/醇处理对木薯淀粉红外光谱的影响

图5为经不同碱/醇溶液处理前后木薯淀粉的红外光谱。由图5可知,原木薯淀粉在3412、2932、1650、1459、1422、1373、1340、1157、1084、994、926 cm-1的峰分别归属于-OH的伸缩振动、-CH2-的不对称伸缩振动、无定形区H2O的弯曲振动、-CH2-的弯曲振动、-CH2-的弯曲振动以及C-O-O的伸缩振动、-CH-的弯曲振动、-CH2-的弯曲振动、C-O和C-C的伸缩振动、结晶区的特征峰、无定形区的C-O、α-1,4糖苷键的骨架模式振动(C-O-C),这与Kumar等[24]对淀粉的红外峰进行的归属相类似。处理后的木薯淀粉与原淀粉相比,既没有生成新的吸收峰,也没有特征峰的消失,说明不同碱并不与淀粉分子形成新的官能团。但是,不同碱处理的木薯淀粉在3412 cm-1处的峰向高波数方向偏移,并且其强度均有所降低,说明不同碱处理使淀粉分子链中的氢键减少。推测其可能是碱金属离子与淀粉分子链中的基团产生静电作用,从而影响淀粉分子链间的有序排列,进而导致分子链中的氢键作用减弱。

图5 不同碱/醇溶液处理的木薯淀粉的红外光谱图Fig.5 FTIR spectra of cassava starch treated with different alkali/alcohol solutions注:a. 原木薯淀粉,b. 氢氧化锂醇溶液处理淀粉,c. 氢氧化钠醇溶液处理淀粉,d. 氢氧化钾醇溶液处理淀粉,e. 氢氧化铷醇溶液处理淀粉,f. 氢氧化铯醇溶液处理淀粉。

2.6 碱/醇处理对木薯淀粉中直链淀粉及还原糖含量的影响

木薯淀粉经不同碱/醇溶液处理前后的直链淀粉含量如图6所示。由图6可知,不同碱对木薯淀粉中的直链淀粉含量有明显的影响,而且随着碱相应金属元素所在周期的增大,直链淀粉含量显著下降(P<0.05),这与Raja[25]报道的碱处理使木薯淀粉的直链淀粉含量下降的结果相似。根据Kim等[26]的报道,直链淀粉含量实际上主要由直链淀粉和支链淀粉的部分长链(B链)两部分组成。Uthumporn等[27]和Othman等[28]的研究表明淀粉中直链淀粉含量下降主要是因为直链淀粉发生降解,而根据样品中总还原糖含量测定的结果可知(图7),所有处理样品中的总还原糖含量均高于原木薯淀粉。根据以上结果可推测碱/醇处理可使木薯淀粉中的直链淀粉发生降解,从而导致总还原糖含量升高。然而对于处理样品中总还原糖含量由高到低的顺序表现为氢氧化钾>氢氧化铷>氢氧化锂>氢氧化钠>氢氧化铯的原因目前尚未清楚,有待进一步研究。

图6 不同碱/醇溶液处理的木薯淀粉的直链淀粉含量图Fig.6 Amylose contents of cassava starch treated with different alkali/alcohol solutions 注:图中不同小写字母表示样品间直链淀粉含量在P<0.05水平上差异显著,图7同。

图7 不同碱/醇溶液处理的木薯淀粉还原糖含量图Fig.7 Concentration of reducing sugar of cassava starch treated with different alkali/alcohol solutions

3 结论

本文利用第IA主族不同碱金属氢氧化物的醇溶液处理木薯淀粉,得出以下结论:不同碱对木薯淀粉颗粒外部的影响相对较小,其主要作用发生在颗粒内部。不同碱处理并未使淀粉分子形成新的官能团,而是影响淀粉内的分子链排列,从而导致其晶型以及相对结晶度发生明显变化(P<0.05),且造成直链淀粉含量由22.30%降低至16.51%。不同碱对木薯淀粉结构的影响呈现出随着碱中的碱金属离子所在相应元素周期的增大而增强的规律性,即氢氧化锂与氢氧化钠对淀粉的影响相对较弱,而氢氧化钾和氢氧化铷的作用居中,作用最强的是氢氧化铯。