(南京财经大学食品科学与工程学院,江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心,江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室,江苏南京 210023)

原产墨西哥的辣椒(Capsicumspp.)是深受世人青睐且种植多、使用广、产消较大的调味作物,其主要辣味物质为辣椒碱[1],辣椒碱含量是衡量和鉴定辣椒品质的关键指标。我国是世界上最大的辣椒生产、消费和出口国,近3年辣椒出口量增长25%以上,贸易量占全球的20%以上[2]。辣椒碱具有优异的抗氧化[3-4]、抗菌[5]和抗癌[6]等生物学活性,良好的测定方法也将有助于对具有不同含量辣椒碱的原料进行初步鉴定。因此,寻求一种能快速简便地检测辣椒碱的方法便具有一定的意义。

对于辣椒碱的检测,现有的色谱法和质谱法存在测定成本高和耗时等问题[7-8],光谱法则存在选择性和准确度不高等问题[9],相比之下电化学法具有快速便捷和成本低廉等优点[10-11],能够准确安全地测定辣椒碱。依据循环伏安法的正(反)向扫描的氧化(还原)峰电流ipk(ipa)的图形特征和峰值大小,可判断此氧化(还原)电对的特性及其相对含量。Manaia等[12]研究表明辣椒碱在正向扫描时,其苯环上的酚羟基易失去电子而生成氧化态(醌),且其氧化特征峰ipk大小与反应体系中辣椒碱含量成正相关,据此可通过测得其ipk值求得测定体系中辣椒碱含量[13]。但该研究只对辣椒碱在各种电化学方法上的行为进行了定性研究,并未对循环伏安法定量测定辣椒碱进行详细分析和优化。此外,采用纳米粒子修饰工作电极将有助于提升对辣椒碱的选择性和灵敏性,但修饰物的成本均较高[14-15]。

本文首先采用自制β-环糊精碳糊电极和玻碳电极对辣椒碱纯品进行了循环伏安扫描,在比较峰型和灵敏度后,选择检测性能较好的β-环糊精修饰碳糊电极作为本研究的工作电极,依次考察了不同缓冲体系、电压扫描速率、体系离子强度、电解质种类、温度和干扰物质对测定的影响。在确定相关最佳条件后,得出了最佳条件下的标准工作曲线和检出限,并考察了方法的精密度、实样和加标回收率,旨在为以电化学法快速简便测定辣椒碱技术提供支撑。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

越南小米辣、贵州灯笼椒 明氏诚信辣业店;印度魔鬼椒、河南小椒 小两口干货特产店;江西甜椒 好美优品店提供;山东小米 辣沂蒙农家味道店;以上共6个品种的10个干鲜辣椒试样分两个批次购得;辣椒碱、辣椒色素 AR,西安维珍生物科技有限公司;维生素C、葡萄糖等其他试剂 AR,国药试剂公司产;测定用水 自制超纯水。

MetrohmAutolab PGSTAT101(配NOVA 2.1.3数据处理软件)电化学工作站 瑞士万通公司;玻碳电极、铜电极、铂丝电极、银/氯化银(Ag/AgCl)参比电极 天津艾达恒晟科技有限公司;232-01型甘汞参比电极 上海仪电科学仪器股份有限公司;XW-80A旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂有限公司;202-00BS真空干燥箱 上海力辰科技有限公司;ME204T/02电子分析天平 梅特勒-托利多国际有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的预处理 将购买的辣椒样品除蒂除杂后,计量并在55 ℃真空干燥箱中烘干4～8 h,粉碎过60目筛,计量、装瓶备用。取粉碎好的试样按文献[16]的方法以料液比1∶20 (m/V)加入无水乙醇于超声功率200 W、频率40 Hz和50 ℃下连续提取1.5 h;提取液趁热用3#砂芯滤器迅速抽滤,冷却后装瓶于4 ℃冰箱内保存备用。

1.2.2 采用循环伏安法测定辣椒碱 用无水乙醇配得的辣椒碱标准溶液(1.0×10-4～1.0 mmol/L),在合适的支撑溶液和缓冲溶液体系中,以饱和甘汞电极为参比电极、铂电极为辅助电极和玻碳电极或自制改良修饰碳糊电极为工作电极的三电极工作体系于电化学工作站上在一定的扫描电压、扫描速率下进行循环伏安模式的扫描,测定相应的标准工作曲线。然后取一定量的试样备用液,按此法测得试样中辣椒碱的含量。

1.2.3 测定条件的选择

1.2.3.1 电极的选择 在底液KCl 0.10 mol/L,辣椒碱2.50 mmol/L,Britton-Robison缓冲体系,pH11,20 ℃,扫描电压速率100 mV/s条件下,经比较测量电极的特性和适用性[17-21]并结合实情,以饱和甘汞电极为参比电极,铂电极为辅助电极,通过自制修饰碳糊电极与玻碳电极的比对试验确定适宜工作电极。

修饰碳糊电极的自制方法:在文献[17-19]的基础上针对实验特点做改良,即处理好的石墨粉∶β-环糊精=10∶1 (m/m)组成混合粉末,再按1.5 g/mL的比例加入液体石蜡后于旋涡混合仪混合5～8 min(边加边混合)得均匀糊状物,并缓慢注入特制聚四氟乙烯管中(用真空法以确保其无气泡),盖上油纸压实,用膜将电极表面打磨至有明显金属光泽即成。

1.2.3.2 缓冲溶液体系及其pH的选定 在调研的基础上[10-11],以β-环糊精修饰碳糊电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂电极为辅助电极,底液KCl 0.10 mol/L,辣椒碱2.50 mmol/L,扫描电压速率100 mV/s,20 ℃条件下,对磷酸钾-磷酸氢二钾(K3PO4-K2HPO4)、磷酸钠-磷酸氢二钠(Na3PO4-Na2HPO4)、碳酸钾-碳酸氢钾(K2CO3-KHCO3)、硼砂缓冲液和Britton-Robison缓冲液的比较,寻得适宜缓冲溶液体系及pH值。

1.2.3.3 其它因素测定条件的选定方法 在β-环糊精修饰碳糊电极为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂电极为辅助电极,辣椒碱2.50 mmol/L,Britton-Robison缓冲体系pH11下,采取单因素法分别对电压扫描速率、调节剂种类、测量体系离子强度和温度等4个因素进行试验,通过测得其工作电流与扫描电压(i～V)曲线的图形和ipk值来确定测定的适宜条件。

1.2.3.4 选择性试验的方法 为消除测定体系干扰物的影响,以循环伏安扫描图的特征峰及峰形特征来判断其影响,并根据所测辣椒试样中可能存在的干扰物质为维生素C、葡萄糖和辣椒色素,所以选择性试验方法为:在所得的适宜条件下,采用添加试样中存在的维生素C、葡萄糖和辣椒色素的1～20倍量进行测试。

1.2.4 方法学考察

1.2.4.1 标准工作曲线和检测限的测定 在适宜条件下,取辣椒碱标液(ccp)分别为10.0、1.0、1.0×10-1、1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4mmol/L,测得其i～V曲线及ipk值。依此得到辣椒碱测量的标准曲线,根据其斜率(k)和空白值测定的标准偏差(Sb)求得其检测限(LODs=3Sb/k)[22]。

1.2.4.2 方法精密度和准确度的测定 方法的精密度以相对标准偏差(RSD)表示。方法准确度用加标实验的回收率和RSD以及与高效液相色谱法(HPLC)[7,23]测定结果的比较来共同表示。

1.2.5 实际样品的测定 在适宜条件下,按1.2.1制得的10个样液分别用循环伏安法和HPLC法测定。

1.3 数据处理

经Nova 2.3.1测得的循环伏安数据,用Excel 2017绘图,用SPSS 19.0做统计处理,且结果以“平均值±SD”表示。

2 结果与分析

2.1 工作电极的确定

按1.2.3.1方法在只改变工作电极下,所得结果见图1。

图1 玻碳电极和β-环糊精修饰碳糊电极的比较Fig.1 Comparison of glassy carbon electrode and carbon paste electrode modified by β-cyclodextrin

由图1知,玻碳电极的氧化峰不很明显,与β-环糊精修饰碳糊电极相比,对辣椒碱的灵敏度较低,而β-环糊精修饰碳糊电极测得的氧化峰十分突出,且峰形颇好,故选β-环糊精修饰碳糊电极做工作电极。

2.2 缓冲溶液体系及其酸度对ipk的影响

按1.2.3.2方法在pH11条件下,仅改变缓冲体系,测得结果见表1。

由表1知,在考察的5种缓冲溶液中以Britton-Robison缓冲体系的ipk最大,且RSD=1.1%,表明Britton-Robison缓冲体系很适合本测定方法及其体系。因此,选取Britton-Robison缓冲体系为佳。

表1 缓冲溶液体系对ipk的影响(n=3)Table 1 Influence of buffer systems on ipk(n=3)

按1.2.3.2方法在Britton-Robison缓冲体系下,仅改变体系pH,测得峰电流结果见图2。

图2 pH与ipk的线性关系Fig.2 Linear correlations between pH with ipk

由图2知,体系pH与ipk间呈强正相关(ipk=0.9673pH-1.7997,R2=0.9835),且当pH11时,ipk最大,反应易发生程度和测定灵敏度都最佳,故选择缓冲溶液体系的酸度为pH11。

2.3 电压扫描速率对ipk的影响

按1.2.3.3方法在底液KCl 0.10 mol/L,20 ℃下,仅改变扫描电压速率,所得结果见图3和图4。

图3 不同扫描速率下工作电流的变化Fig.3 Changes of working current under different scan rates

图4 扫描速率与ipk的线性关系Fig.4 Linear correlations between scan rate with ipk

图3反映出电压扫描速率越高ipk值越大,但扫描速率≥200 mV/s时,会出现电极表面迅速沉积而使循环伏安曲线重现性破坏。虽然当电压扫描速率100 mV/s时,其ipk值不是最大,但它有良好氧化峰形(如图3)和颇佳的重现性(RSD≤1.1%),且单次循环扫描时间也短。因此,电压扫描速率以选100 mV/s为宜。另外,由图4得知,电压扫描速率(v)与ipk间线性关系良好(当v=0～50 mV/s时,线性方程为ipk=0.0971v+0.9084,R2=0.9882;当v=50～500 mV/s时,线性方程为ipk=0.0486v+3.5634,R2=0.9958;且高扫描速率下的线性更好些)。

2.4 体系离子强度对ipk的影响

按1.2.3.3方法在扫描电压速率100 mV/s、20 ℃,仅改变体系离子强度下,所得结果见表2。

表2 离子强度对ipk的影响(n=3)Table 2 Influence of ionic strength on ipk(n=3)

由表2知,当体系离子强度(IS)为0.20 mol/L(调节剂KCl浓度为0.10 mol/L)时,ipk最大,表明此时电极反应极易发生。因此,取IS=0.20 mol/L(调节剂KCl为0.10 mol/L)为宜。

2.5 电解质种类对ipk的影响

按1.2.3.3方法在IS=0.20 mol/L,扫描电压速率100 mV/s,20 ℃,只改变体系电解质种类下,测得结果见表3。

表3 电解质种类对ipk的影响(n=3)Table 3 Influence of electrolyte species on ipk(n=3)

由表3知,在相同离子强度下,以调节剂KCl组的ipk最大,反应的进行和达到平衡都更易。故选用KCl作离子强度调节剂为佳。

2.6 测定温度对ipk的影响

按1.2.3.3方法在底液KCl 0.10 mol/L,扫描电压速率100 mV/s,20 ℃,只改变体系温度下,测得结果见表4。

表4 测定温度对ipk和Epk的影响(n=3)Table 4 Influence of temperature on ipk and Epk(n=3)

2.7 干扰物质对ipk的影响

辣椒中除辣椒碱外,在50 ℃乙醇超声提取可溶出物中可能影响本法对辣椒碱测定的成分有:维生素C、辣椒色素及可溶性糖[24]。为了解其影响,在适宜条件下按1.2.3.4方法所做选择性试验结果见表5。

表5 干扰物质对辣椒碱测定的影响(n=3)Table 5 Influence of interfering substances on determination of capsaicin(n=3)

从表5可看出,在适宜条件下,添加的干扰物未达到饱和时,其循环伏安扫描图(如图5)与图1无差异,未增加新的特征峰,对辣椒碱原有特征ipk的峰形和峰值未产生实质性影响,其ipk的绝对误差为-2.53～3.75 μA,相对误差(Er)均不超过0.94%。可见试样中干扰物的存在并不影响测定,所以实样测定时无需额外采取消除干扰的措施。

图5 添加的干扰物对ipk的影响(n=3)Fig.5 Influence of additional disturbances on ipk(n=3)

2.8 标准工作曲线与检出限的测定

在适宜条件下按1.2.4.1方法所测得结果见图6。

由图6得到,辣椒碱浓度(ccp)为1.0×10-4～10.0 mmol/L内ccp与ipk的方程为ipk=3.1046Ccp+1.0025(R2=0.9946),线性关系良好。依ipk～ccp工作曲线经求算此条件下测定辣椒碱的检测限LOD=0.125×10-3mmol/L(0.3817 μg/mL),此结果与Ferraz等[20]用HPLC法的结果相当。但当ccp较高时,会使碳糊电极表面较快地被反应产物所覆盖物,致使其电阻增加而电流降低最终导致测定结果出现较大偏差;可通过稀释测定本底液的方法确保测定结果准确。

2.9 精密度的测定

在适宜条件下按1.2.4.2方法所测得结果见图7。

图7 辣椒碱测定的稳定性(n=3)Fig.7 Stability of determination of capsaicin(n=3)

由图7可知,在适宜条件下用本法测定辣椒碱标液的ipk值受时间的影响甚小,在测试的48 h内稳定性良好(RSD≤1.8%),特别是半小时内ipk值都几乎恒定。但随时间的延长ipk值呈前稳中升后略降的变化态势。产生这样变化的原因和机理有待进一步探究。

2.10 实样和加标回收率的测定

在适宜条件下对市售两个批次(A、B)10种辣椒试样的测定结果如表6、表7所示。

表7 10种辣椒实样的加标回收率测定结果(n=3)Table 7 Recovery rate of standard addition of 10 kinds of capsicum(n=3)

由表6知,在适宜条件下,10种辣椒样中辣椒碱含量的测定结果显示,本法与HPLC法相当吻合,与文献报道[25-26]也一致。且从表7可见实样的加标回收率为100.70%～109.89%(平均103.71%),RSD为1.1%～4.9%。可见本法对辣椒中辣椒碱的测定准确可靠,能应用于实际。另外从表6、表7中还知:干辣椒中辣椒碱含量高于新鲜辣椒;辣椒品种不同其辣椒碱含量差异很大;同品种辣椒热带地区的印度、越南辣椒碱含量高于非热带地区的河南、山东。这可为需求辣椒碱含量不同的辣椒提供了参考。

3 结论

本实验确定了循环伏安法测定辣椒碱的条件,并对测定参数进行优化。采用β-环糊精修饰碳糊电极的循环伏安法测定辣椒碱的适宜条件为:电压扫描速率为100 mV/s,pH11,离子强度调节剂为0.10 mol/L KCl浓度控制为0.20 mol/L,测定温度约20 ℃,在30 min内结果恒定(RSD≤0.1%)且48 h内测定结果稳定性良好(RSD≤1.8%)。该法的LOD 0.3817 μg/mL,且Ccp在1.0×10-4～1.0 mmol/L内与ipk呈极佳正相关线性关系,其方程为ipk=3.1046Ccp+1.0025,R2=0.9946。加标回收率为100.70%～109.89%(平均103.71%)。另外,本法不受辣椒试样内物质的干扰,测定选择性高,前处理简单,测定速度快,灵敏度较高,可作为辣椒碱含量的定量分析方法。且本法有适合自动化和智能化快捷在线检测的潜能。