殷 娜，严小玉，马 珊，张剑林，徐 敏，王犁烨，程方方，武亚婷，刘维兵，武 运

（1.新疆农业大学 食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.新疆农业大学 科学技术学院，新疆 乌鲁木齐830052：3.新疆维吾尔自治区科技项目服务中心，新疆 乌鲁木齐 830052；4.乌鲁木齐市奶业协会，新疆 乌鲁木齐 830000）

乳酸菌是一类能利用发酵糖类产生大量乳酸的革兰氏染色阳性、无芽孢的细菌的总称，在自然界中分布广泛[1-2]，是人类生活中应用较早的一类微生物，可以起到提高食品风味和改善食品品质的作用[3]。优良的乳酸菌应该具有良好的发酵性和较强的耐受性，从而通过发酵可提高和改善各类乳酸菌发酵食品的营养物质含量以及风味[4]。由于各种不良环境的胁迫及不利因素的影响，严重地抑制了乳酸菌的生长代谢能力，进而影响了其益生功能的发挥及高效活性的利用[5]。目前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产酸乳酸菌菌株，几乎都是通过诱变育种来提高其生产性能，并且诱变育种具有变异范围广泛，类型多样等优良特点，所以诱变是目前使用较广泛的一种育种手段[6]。常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plas ma，ARTP）是常压非平衡放电等离子体的一种[7]。常压室温等离子体诱变与传统的诱变方法相比较，其设备更精良，操作方法更简易，安全系数更高，突变频率高，更重要的是对环境没有污染[8]。ARTP所激发出的活性粒子能够对蛋白质及细胞结构都具有一定的影响，并通过对遗传物质损伤机制的多样性，获得多样的突变体[9-10]，在多种微生物如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、米曲霉菌（Aspergillus oryzae）和酵母菌种选育中得到成功运用[11-15]。目前在国内已有使用其他诱变方法如重离子束辐照法诱变选育高产酸乳酸菌的研究[16]，且目前利用ARTP诱变选育植物乳杆菌细菌素高产菌株的研究较多[17-19]，但鲜有利用ARTP诱变选育高产酸乳酸菌的报道。

在新疆地区发酵酸乳制品种类多样，以至于优质乳酸菌种类多样，地区优势明显，更是发展发酵酸乳制品的理想产区[20]。本试验通过前期从新疆乌鲁木齐农牧民家中采集的酸马乳中分离筛选得到的一株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）YL15，以其为出发菌株，采用常压室温等离子（ARTP）诱变的方式提高植物乳杆菌YL15产酸量，从而来提高后期研究中驴乳发酵制品的品质，同时为植物乳杆菌的广泛应用提供理论技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）YL15：新疆农业大学食品科学与药学学院食品生物发酵与质量安全研究室。

1.1.2 化学试剂

无水乙醇（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；邻苯二甲酸氢钾（分析纯）：天津市盛奥化学试剂有限公司；酚酞（分析纯）：天津市化学试剂三厂。

1.1.3 培养基

MRS肉汤、MRS培养基：青岛日水生物技术有限公司；筛选培养基（含有碳酸钙的MRS培养基）：在MRS培养基中加入3%的碳酸钙。

1.2 仪器与设备

ⅡS常压室温等离子诱变仪：无锡源清天木生物科技有限公司；FA2014N分析天平：北京东南仪诚实验室设备有限公司；LDZX-50KBS立式高压灭菌器：上海申安医疗器械厂；HR40-A2生物安全柜：青岛海尔特种电器有限公司；MJX-100B-Z生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；PTX-FA210电子天平：福州华志科学仪器有限公司；SNB-1数字黏度计：上海天美天平仪器有限公司；FE28 Plus pH计：梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；DHG-9140A电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；TU-1810紫外可见光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；FE20 PLUS pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的活化和菌悬液的制备

首先将保存于冰箱的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）YL15接种于MRS肉汤液体培养基中，于37 ℃条件下放置培养24 h；然后以2%的接种量接入MRS肉汤液体培养基中，于37 ℃条件下放置培养24 h后，接种到MRS固体培养基中。挑选出单菌落接种到MRS 固体培养基斜面上，并放置在37 ℃条件下培养，在冰箱中保存；最后将斜面上的初始菌接种到MRS肉汤培养基，在37 ℃条件下培养24 h，重复两次制备菌悬液。

1.3.2 菌株YL15生长曲线的测定

将在MRS肉汤液体培养基中活化好的YL15菌液以4%的接种量接种到MRS肉汤培养基中，在37 ℃条件下培养，每间隔2 h取一次样，在波长600 nm处测定吸光度值，以空白培养基为对照，根据测得的吸光度值绘制菌株YL15的生长曲线，确定菌株YL15的生长对数期。

1.3.3 ARTP诱变试验

试验前期的准备工作：首先用体积分数75%的乙醇对操作台内部进行擦拭，然后将紫外灯打开杀菌15～30 min。试验参数：工作气体选择纯度为99.999%的氦气（He），气流量调至10 L/min，电源功率设为120 W，操作温度为20 ℃，发射源与菌悬液的工作距离为2 mm，试验处理时间为0 s、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s、120 s。

诱变试验：在无菌条件下吸取1 mL在MRS肉汤中培养至对数期的初始菌株YL15的菌液，在3 000 r/min条件下离心10 min，去掉上清液，吸取10 μL放在载片上，将载片分别放在凹槽中，并将吸有1 mL MRS肉汤的EP管放在下方，便可进行试验，经过诱变处理后利用旋涡混合器将装有载片的EP管剧烈振荡1 min，将载片上的诱变菌全部洗下，梯度稀释10-6～10-8后，取100 μL涂布于MRS固体培养基上，在37 ℃条件下避光培养48 h，统计菌落数，得到致死率，确定最佳诱变时间。致死率计算公式如下：

式中：Z为菌株的致死率，%；X1为ARTP诱变后的菌落数，CFU；X为对照组的菌落数，CFU。

1.3.4 高产酸乳酸菌初筛

从培养48 h的诱变菌株中挑单菌落点接到筛选培养基上，再点接初始菌株YL15作为对照，在37 ℃条件下培养48 h 后，观察诱变菌株的溶钙圈直径，乳酸菌产生的酸性物质和CaCO3反应而出现溶解圈。测量诱变菌株的溶钙圈直径（H）并对诱变菌株的菌落直径（C）进行测定，计算HC值，即菌株溶钙圈直径与菌落直径的比值，挑选其中HC值相比于原始HC值大30%的菌株保存，进行下一步复发酵筛选。

1.3.5 高产酸乳酸菌的复筛

复筛的过程是将初筛得到的产酸能力较高的诱变菌株进行活化，并接种到100 mL MRS 肉汤中在37 ℃条件下培养24 h，通过酸度的测定选取发酵酸度较高的菌株为高产酸菌株，挑选其中产酸量较高的正突变菌株进行保存[21]。

1.3.6 遗传稳定性试验

将突变乳酸菌菌株连续传代培养5次，测定每一代突变菌株的产酸能力，从而验证菌株的突变性能是否能够稳定遗传。

1.3.7 高产酸乳酸菌最适生长条件的研究

将突变菌株在不同温度与pH条件下进行培养，在波长600 nm处测定吸光度值，从而确定其最适生长温度与pH值。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌YL15生长曲线

图1 菌株YL15生长曲线Fig.1 Growth curve of strain YL15

菌株YL15的生长曲线见图1。由图1可知，将菌株YL15接入MRS肉汤液体培养基中，前0～6 h菌株YL15生长处于延滞期，增长相对缓慢，OD600nm值变化波动很小；在6～14 h菌株YL15增长迅速，OD600nm值迅速增加，此时菌株YL15处于对数生长期；在18～27 h后植物乳杆菌步入稳定期，27 h后逐渐进入衰亡。在一定程度上乳酸菌菌株在不同生理状态下对诱变的敏感程度不同，当乳酸菌菌株生长到对数期时，其繁殖力强，生长速度迅猛，且菌种数量以一个稳定的速率增长，对环境因素的影响更为敏感。在对数期进行诱变，可以提高基因突变率和稳定遗传性[22]。因此，本试验对处于对数生长期10 h时的菌株YL15进行诱变试验。

2.2 最佳诱变时间的确定

图2 不同处理时间对菌株YL15致死率的影响Fig.2 Effect of different treatment time on lethally rate of strain YL15

取菌株YL15悬液，按照1.3.3节诱变条件下进行常压室温等离子体诱变处理，然后分别将经过0 s、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s、120 s不同处理时间后的突变株数进行统计，计算致死率，结果见图2。由图2可知，经过统计得到随着处理时间的递增，致死率越来越高，说明乳酸菌对ARTP诱变非常敏感，处理时间为100 s时，致死率达到91.09%；处理时间为120 s时，菌株无存活。当致死率＞90%时，菌株突变产生高产突变的概率相对较高，且菌株在此突变率下恢复突变的概率更小[23]。因此，考虑到乳酸菌的敏感性及ARTP诱变的稳定性，最终将本试验ARTP 诱变的处理时间确定为100 s。

2.3 诱变菌株初筛结果

挑选单菌落点接到含碳酸钙的MRS 固体培养基上，再点接初始菌株YL15作为对照，测定菌株溶钙圈直径与菌落直径，计算HC值，结果见表1。

表1 诱变菌株的初筛结果Table 1 Preliminary screening results of mutagenic strains

由表1可知，初始菌株YL15的平均HC值为2.915，通过初筛筛出HC值超出初始菌株YL15 HC值30%的菌株6株，分别为YL15-3、YL15-4、YL15-6、YL15-21、YL15-30和YL15-31，其HC 值范围在3.824～3.962之间。因此，对初筛出的6株菌株进行进一步复筛。

2.4 诱变菌株复筛结果

图3 诱变菌株复筛结果Fig.3 Secondary screening results of mutagenic strains

测定6株菌株的酸度，其产酸情况见图3。由图3可知，初始菌株YL15的产酸量为10×10-3mol/L，诱变菌株YL15-3：15.4×10-3mol/L、YL15-4：17×10-3mol/L、YL15-6：15×10-3mol/L、YL15-21：16×10-3mol/L、YL15-30：14×10-3mol/L和YL15-31：14.7×10-3mol/L，与初始菌株YL15相比，突变菌株的产酸能力明显提高，与初筛结果相符。6株突变菌株产酸顺序由大到小依次为：菌株YL15-4＞菌株YL15-21＞菌株YL15-3＞菌株YL15-31＞菌株YL15-30＞菌株YL15-6。王璐等[24]在自然发酵苹果原浆样品中分离筛选出的植物乳杆菌S3-1024h时的产酸量为10×10-3mol/L，与植物乳杆菌S3-10相比，诱变后的6株菌株的产酸量明显高于菌株S3-10。通过ARTP诱变能够改变菌株的某些基因，从而改变菌株的某些特性。因此，最终将突变菌株YL15-4确定为目标菌株。

2.5 遗传稳定性试验结果

图4 菌株YL15-4连续5代产酸情况Fig.4 Acid production of strain YL15-4 for 5 successive generations

将突变菌株YL15-4培养5代，测定每一代菌液的产酸量，结果见图4。由图4可知，第二代菌株最高产酸量为17×10-3mol/L，第三代菌株最高产酸量为15×10-3mol/L。虽然5代菌株的产酸能力存在微小差距，但是平均产酸量都维持在16.1×10-3mol/L左右。由此可以表明，突变菌株YL15-4的高产酸性能可以稳定的遗传。

2.6 诱变菌株的最适生长条件

2.6.1 最适生长温度

图5 菌株YL15-4的最适生长温度Fig.5 Optimal growth temperature of strain YL15-4

在微生物生长繁殖过程中温度对其影响较大，因此为了充分利用该菌株，对菌株YL15-4最适生长温度进行测定，结果见图5。由图5可知，随着温度在30～37 ℃范围内的升高，OD600nm值呈上升趋势，温度在37 ℃时，OD600nm值最大为2.1，温度在37～45 ℃范围的升高，OD600nm值呈下降趋势。因此，菌株YL15-4最适生长温度为37 ℃。

2.6.2 最适生长pH值

图6 菌株YL15-1的最适生长pH值Fig.6 Optimal growth pH of strain YL15-1

pH值过高或过低都会严重影响菌株的生长，对菌株YL15-4最适生长pH值进行测定，结果见图6。由图6可知，在pH值为4.0～5.0范围内，菌株生长较为迅速，pH值＞5.0之后，OD600nm值有所下降。因此，菌株YL15-4最适生长pH值为5.0。

3 结论

本研究通过以新疆乌鲁木齐农牧民家中采集的酸马乳中分离筛选出植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）YL15，在确定工作气流量、电源功率、操作温度以及等离子体发射源与菌悬液的距离后，经单因素试验确定在最佳诱变处理条件为120 W照射100 s。利用筛选培养基及pH测定试验对照射后挑选的33株突变菌株进行初筛，最后再通过产酸能力测定试验确定目标菌株为YL15-4，其产酸量为15×10-3mol/L，高于初始菌株的YL15产酸量的50%。突变菌株YL15-4遗传性能稳定，最适生长温度为37 ℃，最适生长pH值为5.0。植物乳杆菌在发酵制品、开发功能益生产品方面有更广阔的应用前景。