王家旺，邓利廷，孙 健，葛菁萍

（1.黑龙江大学 农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150500；2.黑龙江大学 生命科学学院微生物省高校重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150080）

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种单细胞真菌，作为重要的生产用微生物，在医药、食品和生物能源等方面被广泛应用[1-2]。酿酒酵母具有易于培养、繁殖迅速、代谢产物少、碳源利用率高以及可存活于较低pH环境的特点[3-4]；并且，酿酒酵母被认为是安全的微生物，遗传背景清晰，基因操作技术成熟，是一种模式微生物，便于进行基因改造[5]。2,3-丁二醇（2,3-butanediol，2,3-BD）作为一种平台化合物，被广泛应用于食品、医药以及航空航天等领域。目前，2,3-BD的生产方法主要有化学合成法和生物转化法两种[6]。前者生产成本高、工艺繁琐、不易操作以及对环境污染严重等缺点而很难得到广泛应用[7]。而生物转化法是利用微生物发酵来生产2,3-BD，其生产成本低、条件温和以及易于操作，同时符合低碳、环保和经济的发展目标，受到越来越多的关注[8]。因此，以酿酒酵母作为出发菌株生产2,3-BD具有一定优势。

酿酒酵母在以葡萄糖为底物产2,3-BD的过程中，丙酮酸通过乙酰乳酸合成酶合成a-乙酰乳酸，其在微氧条件下能够自发脱羧生成双乙酰，在双乙酰还原酶的作用下生成乙偶姻并通过BDH转化为2,3-BD[9-10]。因此，生成2,3-BD的主要酶为2,3-丁二醇脱氢酶（2,3-butanediol dehydrogenase，BDH），乙偶姻作为2,3-BD的前体物质，可直接转化产生2,3-BD。因此，可通过研究乙偶姻的产生情况，来筛选出具有2,3-BD产生能力的菌株。GONZALEZ E等[11]通过减少2,3-BD的产生，发现其增加了乙偶姻的积累。MOES J等[12]研究发现，改变溶氧水平可使乙偶姻与2,3-BD进行相互转化。LI L等[13]将阴沟肠杆菌的BDH基因表达在了大肠杆菌中，使2,3-BD的产量大幅提高。检测2,3-BD的方法主要有色谱法，虽然可较直接测定其含量，但对设备要求较高，费时费力[14]。而由于2,3-BD可直接由乙偶姻转化产生，两者之间有着密不可分的关系。因此，利用一种快速简单的方法去检测乙偶姻的含量，以达到筛选2,3-BD生产菌株的目的。

本研究将39株W系列菌株（W4、W22、W23、W25、W27、W39、W41、W55、W57、W58、W61、W63、W65、W66、W67、W68、W70、W74、W82、W87、W96、W108、W109、W117、W119、W120、W121、W124、W130、W132、W135、W139、W140、W141、W143、W144、W148以及W149）、土壤样品中分离出的5株菌株（Y1、C1、Y2、Z1和E1），以及酒糟中分离出的1株菌株（J1）作为候选菌株，进行可产2,3-BD菌株的筛选。并使用形态学和分子生物学手段对高产2,3-BD的菌株进行鉴定，之后摇瓶发酵培养进行菌株发酵性能（OD600nm、pH、葡萄糖剩余量以及2,3-BD产量）的检测。其研究结果为酿酒酵母（S.cerevisiae）菌株的利用提供了理论基础与指导，并有助于深入了解2,3-BD产生的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株与质粒

菌株W4、W22、W23、W25、W27、W39、W41、W55、W57、W58、W61、W63、W65、W66、W67、W68、W70、W74、W82、W87、W96、W108、W109、W117、W119、W120、W121、W124、W130、W132、W135、W139、W140、W141、W143、W144、W148以及W149等：黑龙江大学微生物重点实验室提供；菌株Y1分离于鱼塘、菌株C1分离于菜园、菌株Y2分离于玉米场、菌株Z1分离于猪舍、菌株E1分离于鹅棚、菌株J1分离于酒糟；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α：黑龙江大学微生物重点实验室提供；pMDTM18-T（产品号6011）：大连宝生物有限公司。

1.1.2 化学试剂

蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、酵母基础氮源培养基（yeast nitrogen base，YNB）（均为生化试剂）、氯化钠、葡萄糖、（NH4）2SO4、KH2PO4、无水CaCl2、K2HPO4、MgSO4·7H2O、（NH4）2HPO4（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；质粒小提试剂盒（目录号DP103）、酵母基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒（目录号DP307-02）、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（目录号DP209）：天根生化科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白含量测定试剂盒（目录号YW3-1）：苏州科铭生物技术有限公司。

1.1.3 培养基

LB液体培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。121 ℃高压灭菌15 min。

LB固体培养基：于LB液体培养基中加入2%的琼脂粉。121 ℃高压灭菌15 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液体培养基：蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，pH值自然。108 ℃高压灭菌20 min。

YPD固体培养基：于YPD液体培养基中加入2%的琼脂粉。108 ℃高压灭菌20 min。

发酵培养基：葡萄糖80 g/L，无氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）3.4 g/L，蛋白胨20 g/L，K2HPO43 g/L，KH2PO411.8 g/L，（NH4）2SO410 g/L，pH值自然。108 ℃高压灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

LC20A高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：岛津国际贸易（上海）有限公司；JY92-2D超声波细胞粉碎机：宁波新芝有限公司；Alphalmager HP凝胶成像系统：美国Protein Simple公司；A560紫外可见分光光度计：翱艺仪器（上海）有限公司；ABI9700聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：美国Life Technologies公司；PB-21 pH计：赛多利斯科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌酸显色法筛选2,3-丁二醇产生菌

在碱性介质中，乙偶姻与含胍基的化合物反应生成红色物质，并且在α-萘酚存在的情况下可以促进并加速红色物质生成，利用这一化学特性对菌株进行筛选，筛选出具有明显显色的菌株用于后续试验。由于该红色络合物在波长520 nm处有光吸收，其吸光度值与乙偶姻浓度成正比，依此对发酵液中的乙偶姻同时进行了定量检测[15-16]。

乙偶姻标准曲线绘制：分别取质量浓度分别为0、0.1g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L的乙偶姻标准品溶液25 μL，加入5%α-萘酚1 mL，0.5%肌酸1 mL，10%NaOH 1 mL和ddH2O 7 mL，30 ℃、140 r/min培养30 min后在波长520 nm条件下测其吸光度值。

将活化至对数期的菌株，分别按5%的接种量接种到以80g/L葡萄糖为单碳源的发酵培养基中，装液量100mL/250mL，30 ℃、140 r/min发酵72 h。每隔12 h取样，按绘制标准曲线回归方程计算乙偶姻含量。

1.3.2 菌株的鉴定

根据《酵母菌分类学研究》第四版中的酵母菌鉴定标准方法，利用光学显微镜和体视镜进行观察，观察细胞的大小及形态、菌落质地、菌落颜色、菌落表面特征、菌落边缘和生殖特征等，进行形态学鉴定。

根据18S rDNA序列的保守性，采用真菌18S rDNA通用引物NS1（5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'）和NS8（5'-TCCGCAGCTTCACCTACGGA-3'）进行PCR扩增，PCR扩增体系：模板DNA 2μL，上下游引物（1 pmol/μL）各1 μL，Prime STAR Max Premix（2X）12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸60 s，共30个循环；72 ℃再延伸5 min。将利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收得到的PCR产物与pMDTM18-T载体连接，利用热激法转化至大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞中，并涂布于含有氨苄青霉素（终质量浓度为100 μg/mL）的LB平板上，挑取长势较好的白色单菌落进行菌落PCR鉴定（使用引物NS1和NS8），将验证正确的菌落接种至LB培养基中进行过夜培养，送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。将测序结果提交至美国国家生物信息中心（national center for biological information，NCBI）利用BLAST程序分析比对测序结果，寻找与目的序列相似性最高的已知分类地位的酵母菌，利用MEGA 6.0软件绘制系统发育树，判断种属分类地位。

1.3.3 菌株发酵性能探究

将活化至对数期的菌株，按5%的接种量和100mL/250mL的装液量，接种到底物质量浓度为80 g/L的发酵培养基中，30 ℃、140 r/min振荡培养72 h，每隔12 h取样一次，测定发酵液在波长600 nm条件下的吸光度值（OD600nm）和发酵液的pH值变化，用HPLC检测菌株底物消耗与产物生成情况，包括葡萄糖剩余量以及2,3-BD的产量。

1.3.4 BDH酶活检测

将活化至对数期的出发菌株按5%的接种量，接种到装液量为150mL/500 mL，底物质量浓度为80g/L的发酵培养基中，30 ℃、140 r/min振荡培养72 h，每隔12 h取样，13 000 r/min常温离心8 min收集菌体，加入1 mL pH 6.5磷酸盐缓冲液后再次离心弃上清，加入1.5 mL pH 6.5磷酸盐缓冲液，超声波破碎菌体（功率20%，超声3 s，间隔10 s，重复30次），4 ℃，8 000 r/min，离心10 min，收集上清并进行2,3-丁二醇脱氢酶（BDH）酶活测定[17]。2,3-丁二醇脱氢酶酶活定义：是指在最适条件下，在1 min内能转化1 μmol底物的酶量为1个酶活力单位（U/mg）。

2 结果与分析

2.1 肌酸显色法筛选2,3-丁二醇产生菌

从酿酒酵母代谢葡萄糖产2,3-BD的路径可以看出，乙偶姻是2,3-BD产生的最直接前体物质，菌株对乙偶姻的积累和转化间接反映出其生产2,3-BD的能力。因此，利用肌酸显色法对菌株进行筛选，W5、W25、W27、W39、W41、W58、W61、W87、W96、W108、W119、W135、W141、J1、Z1、Y2、C1和E1等18株菌株具有明显地显色效果。乙偶姻产量测定结果见图1。

图1 乙偶姻产量测定结果Fig.1 Detection results of acetoin content

由图1可知，乙偶姻的积累量呈现先增高后降低再增高的趋势，并且大部分菌株在发酵12 h时出现第一个积累点，这可能是由于在发酵之初菌株大量利用葡萄糖促进自身生长繁殖，使得乙偶姻得以积累。24 h到60 h的乙偶姻积累量逐渐降低，但在72 h时升高。12 h和72 h这两个时间点也成为了影响2,3-BD产量的关键点[18]。菌株W141乙偶姻产量最大为0.225 g/L（12 h），其次是W96，产量为0.223 g/L（48 h）。因此，选择菌株W141进行下一步实验。

2.2 菌株的鉴定

2.2.1 形态学鉴定

取稀释适当倍数的菌株W141的菌悬液于光学显微镜下观察细胞形态（图2A），细胞呈卵圆形、5～7 μm左右、繁殖方式为出芽繁殖；在体视镜下观察菌落形态（图2B），菌落为乳白色、湿润、隆起、菌落整体黏稠、表面较光滑、容易挑起、质地较均匀、直径在0.5～0.6 cm、正反面与边缘以及中心部位的颜色都很均一。

图2 菌株W141菌落形态（A）和细胞形态（B）Fig.2 Colony morphology (A) and cell morphology (B) of strain W141

2.2.2 分子生物学鉴定

18S rDNA序列系统进化树分为多个簇，每簇之上又分出若干亚簇，表明酵母之间的遗传多样性。以菌株DNA为模板，PCR扩增菌株的18SrDNA基因，得到碱基长度为1702bp，结果见图3。

图3 菌株W141基于18S rDNA序列系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of strain W141 based on 18S rDNA sequences

由图3可知，在此进化树中，菌株W141处于进化树的上部亚簇中，与酿酒酵母（S.cerevisiae）strainFJU-YS5（EF153845.1）的亲缘关系最近，序列的相似度达到99%。结合形态学观察结果，菌株W141被鉴定为酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）。

2.3 菌株发酵性能探究

将菌株活化至对数期，按5%的接种量接种到装液量为100 mL/250 mL，葡萄糖质量浓度为80 g/L的发酵培养基中，30 ℃、140 r/min振荡培养72 h，每12 h取样一次，测定pH、OD600nm、葡萄糖剩余量以及2,3-BD产量，结果见图4。

图4 发酵过程中pH（A）、OD600nm值（B）、葡萄糖剩余量（C）和2,3-丁二醇产量（D）的变化Fig.4 Changes of pH (A),OD600nmvalue (B),glucose content (C) and 2,3-butanediol production (D) during fermentation

由图4A可知，在发酵之初发酵液的pH值为5.59，但在发酵时间为12～24 h，由4.75逐渐下降至3.96，之后在4.00左右逐渐趋于稳定，由于在以葡萄糖为底物发酵产2,3-BD的过程中，也产生了乳酸以及乙酸等酸性物质，使得发酵液中的pH有所下降，但是在发酵后期，发酵液中菌体生长也开始稳定，所以pH也变化不大。

由图4B可知，OD600nm值在前24 h内迅速增加至1.4，这可能是由于在前24 h处于菌株生长的对数生长期，所以OD600nm值增加明显。而后增长的并不明显，到了60 h小幅上升至1.5。OD600nm值的总体变化情况是，随发酵时间的延长不断增加，在24 h时达到最大并保持大致稳定。

由图4C可知，对于添加的80 g/L葡萄糖，在前12 h内的葡萄糖含量迅速消耗至16 g/L，并在第24 小时被消耗掉，这可能是由于在发酵前期菌株生长速度较快，需要吸收大量的葡萄糖来维持自身的生长，而后期菌株生长速度较平稳，所以葡萄糖的利用速度也较慢。

由图4D可知，而对于2,3-BD的生成情况来说，在第36 小时开始逐渐产生2,3-BD，并逐渐增加至最大值1.6 g/L（72 h），并且在60h至72h内产生的最多。由于发酵葡萄糖生产2,3-BD的代谢较复杂，也会产生其他物质，所以转化成2,3-BD也需要逐步进行，所以一开始并没有产生2,3-BD。NG C Y等[19]对酿酒酵母中的adh基因进行敲除后，2,3-BD的产量达到2.29 g/L，本研究结果与其尚有一定差距。

2.4 BDH酶活检测

BDH活性随发酵时间的变化情况见表1。

表1 发酵过程中2,3-丁二醇脱氢酶活性的变化Table 1 Change of 2,3-butanediol dehydrogenase activity during fermentation

由表1可知，在整个72 h的发酵期间内，酿酒酵母（S.cerevisiae）W141的BDH活力呈逐渐增大的趋势，并从第36 小时增加明显，并在第72小时达到最高值0.025 7 U/mg。由于生成2,3-BD的主要酶为BDH，因此，酿酒酵母（S.cerevisiae）W141具有较好的2,3-BD生产能力。结合相关文献[20]可知，如果要进一步地增加2,3-BD的产量，可以过表达bdh基因，从而使BDH酶活增加，以达到增加2,3-BD产量的目的。

3 结论

本研究通过显色方法对可产2,3-BD菌株的筛选，通过形态学鉴定以及分子生物学鉴定对高产2,3-BD菌株进行分析，最后进行发酵检测。结果表明，菌株W141被鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），其BDH酶活力高，并且有一定地2,3-BD产量，可作为2,3-BD的生产菌株。而在酒糟、猪舍、玉米场、菜园和鹅棚等地分离的菌株也有一定的产2,3-BD的潜能。本研究所得结果对进一步筛选高产2,3-BD的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株提供了技术支持，同时也扩大了该菌株的研究体系。