胡一敏，刘 琼，戴思涵，郭婧玮

（1.湖南师范大学附属第一医院，湖南省人民医院，长沙 410006；2. 湖南省胸科医院，湖南省结核病防治所，长沙 410016）

结核病是目前最重要的感染性疾病之一。据世界卫生组织报导［1］，2017年全世界结核患者为1000万人，结核死亡人数为160万人。其中新发结核为640万人，我国占9%，位列第二位。同时，全球有17亿人存在结核潜伏感染，控制消灭结核病任务非常艰巨。因此及早诊断发现结核，对于控制结核病的传播至关重要。

目前，结核病的诊断方法包括了涂片镜检、培养、分子生物学诊断等。其中，分子生物学诊断耗时短、敏感性高、特异性强，已经成为结核病诊断过程中最重要的方法之一。在分子生物学检测中，应用的靶基因非常多。包括了groEl、mtb-4和dnaJ编码基因［2，3］、16S-23S基因区、热休克蛋白hsp 65编码基因、16s rRNA、IS986基因、IS6110基因。其中以IS6110敏感性和特异性最好，应用也最广泛［4］。但IS6110基因仍存在着一些缺陷［3，5］：一些特定的结核株，尤其是在亚洲东南被发现的北京菌株，缺乏这个插入序列；一些牛分枝结核杆菌菌株IS6110基因拷贝数低；结核分枝杆菌复合群中IS6110基因拷贝数变异大等。因此，发现新的优异的靶基因尤为重要。

细胞色素P450（CYP）属于血红素蛋白家族［6］，在结核分枝杆菌中有20个成员。其中，CYP141是一种中间代谢和呼吸蛋白，可干扰结核分枝杆菌的氧化还原，并对结核分枝杆菌的毒力具有重要作用［7］，近年来在药物治疗和疫苗领域被广泛研究［6］。CYP141编码基因非常保守，位于RD12区，存在于所有结核分枝杆菌菌株中［8］。2011年，该基因首次被Darban-Sarokhalil等［9］引入并用作直接检测结核临床标本的靶标。随后，CYP141基因被应用于临床标本的检测中，荧光定量PCR检出限为100拷贝数［8，10］，敏感性高，特异性好。上述研究均表明CYP141基因有望成为结核分枝杆菌复合体检测的良好靶标。但目前国内外关于CYP141基因与传统靶标平行比较的数据极度缺乏，CYP141应用于结核诊断的优势尚待明确。本研究拟通过与最常用的经典靶标IS6110基因相比较，评价CYP141基因在结核病辅助诊断中的价值，指导临床早期诊断及治疗。

1 材料与方法

1.1 标本收集收集2019年3月～2019年10月湖南省结核病防治所收治的疑似结核患者的痰标本122例、临床菌株91例。结核分枝杆菌所有标本均在固体改良罗氏培养基上培养（≤8周［11］），采用萋尼氏抗酸染色、PNB（对硝基苯甲酸）生长试验和TCH（噻吩-2-羧酸肼）生长试验鉴别确认［13］。选取结核分枝杆菌H37Rv株做为标准菌株。

1.2 DNA提取提取前处理：临床痰标本在提取DNA之前先加1～2倍体积的4% NaOH震荡混匀，再静置15 min备用；临床菌株则取灭菌EP管，加入1000μL去离子水，从罗氏培养基斜面上刮取适量菌株分别放入管内，制成菌悬液备用。

提取步骤：所有临床菌株和标本均采用超声波裂解法。首先取灭菌EP管，加入1000μL的菌液或者消化处理好的痰标本，放在金属浴上85℃灭活20min，12000 r/min离心5 min，弃上清。再每管加入1000μL无菌蒸馏水重悬沉淀，12000 r/min离心5 min，弃上清。每管再加入100μL无菌蒸馏水，95℃金属加热20 min，然后超声裂解15 min。最后12000 r/min离心5分钟，上清即为提取好的DNA样本。

1.3 PCRIS6110扩增引物为：IS-F 5'-CCTGCGAGC GTAGGCGTCGG-3'和IS-R 5'-CTCGTCCAGCGCCGCT TCGG-3'［11］；CYP141扩增引物为：CYP-F 5’-ATGACA AGCACCTCGATTCC-3’ 和CYP-R 5’-T CGGA CAGCACTCCCTTTAC-3’［10］。使用NCBI BLAST确认了所有引物的特异性。

PCR反应总体积为25μL。标准菌株和临床菌株的反应体系如下：DNA模板2μL，上游引物和下游引物各1μL，Taq PCR Master MIX 12.5μL（上海生工），dd H2O 8.5μL。临床标本经过优化后反应体系为：DNA模板5μL，上游引物和下游引物各1μL，Taq PCR Master MIX 12.5μL（上海生工），dd H2O 5.5μL。所有的反应均在同一台PCR仪（杭州博日）中进行。

IS6110反应条件：95℃10 min初始变性；95℃30秒变性，65℃ 30秒退火，72℃ 20秒延伸，共35个循环；72℃ 5 min最后延伸［14］。CYP141反应条件：95℃10 min初始变性；94℃ 25秒变性，58℃ 30秒退火，72℃ 30秒延伸，共35个循环；72℃ 3分钟最后延伸［10］。反应完成后，将PCR反应产物点样7μL于1.5%的琼脂糖凝胶电泳，150mV电泳30分钟，用GelRed核酸染料染色后在紫外照射下观察结果。

1.4 统计学分析两基因检测结果的比较采用配对设计四格表的χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标准菌株扩增结果使用结核分枝杆菌标准菌株H37Rv扩增后，结果如图1所示。CYP141扩增后目的片段大小为173bp，IS6110扩增后目的片段大小为123bp，从图1可以，CYP141扩增产物量要明显多于IS6110。

2.2 临床菌株和临床标本扩增结果研究中我们收集了临床菌株91例，使用CYP141扩增后91例均为阳性，灵敏度为100%，使用IS6110扩增后90例为阳性，灵敏度为98.9%。紫外照射下，CYP141扩增产物明显比IS6110亮，说明CYP141扩增产物要明显多于IS6110。电泳结果如图2所示。

图1 标准菌株扩增结果1：IS6110扩增结果2：Marker（100bp-600bp）3：CYP141扩增结果

研究中我们收集了临床痰标本122例，其中培养阳性标本63例，CYP141检出阳性为27例，灵敏度为42.9%，IS6110检出阳性38例，灵敏度为60.3%；培养阴性标本59例，使用CYP141扩增后均为阴性，特异性为100%，使用IS6110扩增后也均为阴性，特异性为100%。结果见表1。IS6110的敏感性要明显高于CYP141（P＜0.05），结果见表2。

图2 临床分离菌株扩增结果：A图为IS6110扩增产物，第1到第9泳道均为临床菌株，M为Marker；B图为CYP141扩增产物，第1到第10泳道均为临床菌株，M为Marker（100bp-600bp）。

表1 CYP141和IS6110在临床菌株和临床痰标本中的检测结果

表2 CYP141与IS6110在临床痰标本中的检测结果比较

3 讨论

本研究选取了临床菌株和临床标本两类对新靶标CYP141基因的临床应用价值进行了评价。在对临床菌株的检测中，新靶标CYP141的敏感性稍高于IS6110，扩增产物量比IS6110多，特异性与IS6110一致。CYP141对中国地区结核分枝杆菌检测的优势，在本实验的临床菌株的检测中得到了证实。出现这个结果的原因可能是CYP141基因存在于除牛结核分枝杆菌BCG株之外的所有结核分枝杆菌复合群中［14］，而IS6110在一些特定的结核株（如北京株）中不存在［3］。这一研究结果也与国外学者们的研究结果一致［15］。此外，有研究表明，与IS6110基因在结核分枝杆菌复合群中拷贝数变异大［5］的情况不同，CYP141在结核分枝杆菌中是单拷贝数，非常适合应用于结核分枝杆菌的定量检测（如荧光定量PCR等）［10］。CYP141靶基因的这些优势可应用于更多的结核分枝杆菌的分子诊断方法中去，如基因芯片等［16］。

但本次在对临床标本的研究中，新靶标CYP141的敏感性却低于IS6110，出现了和临床菌株完全不同的结果。这一研究结果与国外学者Babak Farzam等［16］的研究结果也不同。其原因可能是临床标本中的模板浓度、反应抑制物浓度与临床培养菌株不同。PCR反应的影响因素包括PCR聚合酶质量，反应模板浓度，反应抑制物浓度等。我们的提取方法相对简单，提取出的结核分枝杆菌浓度低，反应抑制物多，从而导致反应的敏感性欠佳。国外基本是使用昂贵的商业化提取试剂盒，提取的模板浓度更高，抑制物更少，因而国外学者的研究中新靶标CYP141的敏感性可能会更好。相信随着临床标本提取技术的发展，CYP141在临床标本检测中的优势将不断凸显。但与国外学者Babak Farzam等［15］的建议相反，本研究认为，在目前国内的提取技术下，CYP141基因用作临床标本单纯PCR检测的结果并不理想，需要慎重。

综上，结核分枝杆菌CYP141基因在临床分离菌株检测中具有良好的特异性和敏感性，在结核分枝杆菌的分子诊断方面有很好的应用价值。同时随着临床标本提取技术的进步，CYP141有望取代IS6110成为结核分枝杆菌分子诊断更理想的靶标。