李 渊,高晓霞,王 慧,王 鹏,贾金萍,秦雪梅*

(1山西大学中医药现代研究中心,太原 030006;2山西大学大型仪器中心;*通讯作者,E-mail:qinxm@sxu.edu.cn)

抑郁症(depression)[1-3]是以显著且持久的情绪低落为主要临床特征,呈无趣、无欲、无助、无望、无快感的状态,严重者甚至自杀,是目前最常见的精神障碍之一,也是致残的主要原因之一,严重影响患者的生活、工作和学习。

前期本课题组经过对逍遥散的最佳抗抑郁组分的药效学筛选和抗抑郁物质基础的研究后,在“逍遥散”组方的基础上裁去生姜和茯苓而得到复方柴归方,并对其提取工艺进行了优化[4-8]。复方柴归方主要针对抑郁症患者而研发,由柴胡、当归、甘草、白术、白芍、薄荷6味药组成。目前已获得国家药品监督管理局(SFDA)颁发的临床试验批件。

Wilsonth等[9]在1954年建立了外翻肠囊法。最初用于研究葡萄糖和氨基酸在肠道中的代谢和转运。它是体外最常用的肠道吸收生物学模型,具有操作简单、胶囊内液体少、药物积累快、药物用量少的特点[10]。所以选择了外翻肠囊法考察复方柴归方提取物在大鼠空肠和回肠的吸收特点。

本文在前期对柴归方化学成分研究的基础上[8],对柴归方的在体肠吸收进行研究,并比较其在正常大鼠与抑郁症大鼠(CUMS)体内肠吸收成分种类与吸收程度的差异,筛选具有显著吸收差异的化学成分,试图阐明柴归颗粒的吸收特点。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高速冷冻离心机,Thermo fisher U3000超高效液相色谱仪,Thermo Scientific Q Extractive质谱仪(Thermo Scientific,Germany); Neofuge 13R高速冷冻离心机(上海力申科学仪器有限公司);甲酸、乙腈购买于赛默飞世尔科技(中国)有限公司;其余试剂均为分析纯;复方柴归颗粒(为本实验室用乙醇提取合并药渣水提醇沉部分制备)。

1.2 检测条件

色谱条件:色谱柱为Waters HSS C18柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);检测波长254 nm;进样量2 μl;流动相:A为0.1%甲酸-水,B为乙腈流速0.3 ml/min,柱温40 ℃,梯度洗脱:0-5 min,5%-10% B;5-12 min,10%-10% B;12-16 min,10%-20%B;16-25 min,20%-35% B;25-30 min,35%-40%B:30-40 min,40%-50% B;40-48 min,50%-85%B;48-50 min,85%-100%B[8]。质谱条件:电喷雾离子源(EIS),扫描方式:ESI(+),ESI(-)以及全扫描模式;喷雾电压正极:3.5 kV,负极:3.0 kV;毛细管温度320 ℃;加热器温度300 ℃;鞘气流速:35 arb,辅助气流10 arb;扫描模式为Full Scan/dd-MS2,采集范围为m/z100-1 500,正负离子切换采集模式。

1.3 实验动物

健康雄性SD大鼠,SPF级,体质量为(400±50)g,购于北京维通利华实验动物科技有限公司,动物许可证号SCXK(京)2014-0001,动物置于自然节律光照环境下,适应性饲养1周,室温22-24 ℃,相对湿度35%-55%。

1.4 柴归颗粒肠内溶液样品的制备

1.4.1 Tyrode缓冲液的配置 精密称取NaCl 8.0 g,KCl 0.28 g,MgCl20.1 g,NaHCO31.0 g,NaH2PO40.05 g溶于500 ml蒸馏水中,密闭冷藏;另称取0.2 g CaCl2溶于500 ml蒸馏水中密闭冷藏;使用前将2种溶液混合后加入无水葡萄糖1.0 g,并用玻璃棒搅拌均匀,即得Tyrode缓冲液。

1.4.2 复方柴归方药液的制备 准确称取复方柴归方123.5 g,加500 ml Tyrode缓冲液超声完全溶解,制成浓度为0.247 g/ml的含药Tyrode试液。

1.4.3 复方柴归方肠吸收液的制备 正常大鼠和CUMs模型大鼠,每组3只,自由饮水,实验前禁食12 h,用10%的水合氯醛酸腹腔注射麻醉,其剂量为0.3 ml/100 g,待大鼠麻醉后固定,沿大鼠的腹中线和腹白线剪开肌肉,打开腹腔,迅速取出小肠,从幽门胃下面25 cm开始向下量取10 cm为空肠段;从回盲瓣以上5 cm开始向上取10 cm为回肠段。取出空肠与回肠段的肠管放入0 ℃台式液中冲洗干净,小心剥离肠管表面的肠系膜。将肠管一端套牢在自制的塑料套管上,并用细线扎牢固,小心将肠管翻转。用0 ℃台式液将内表面冲洗干净。把肠段的一端用丝线结扎,注入2 ml空白台式液后结扎另一端。将其置于恒温37 ℃并已供气(95% O2+5% CO2)的浴管中。平衡5 min后将Tyrode替换为适量的柴归颗粒供试药液。120 min后取样,保存于-80 ℃,待用。

1.4.4 肠内溶液分析样品的制备 取1 ml样品用氮气吹干,向其中加入500 μl的色谱甲醇,混匀溶解。13 000 r/min离心5 min,取上清液,进样分析。

1.5 数据分析

数据分析和画图采用Xcalibur3.2,SPSS v16.0,GraphPad Prism8,SIMCA13.0,和Compound Discover软件。

2 结果

2.1 柴归颗粒中有机酸类和皂苷类的吸收特征

经过Xcalibur软件对肠灌流液的色谱图进行分析,图1是柴归颗粒肠内溶液在正负离子模式下的总离子提取离子流图(TICs)。前期对柴归颗粒的化学成分研究,共鉴定出95个化合物,包括皂苷类,萜类,黄酮类,内酯类,苯肽类和酚酸类等。在肠内溶液中共指认出70个共同的肠吸收化合物(见表1),25个未检测到。说明柴归颗粒中小分子化学成分多数能够经肠道被吸收。

2.2 柴归颗粒在正常组和CUMs模型组大鼠肠段中的吸收情况

根据前期对柴归颗粒中化合物指认结果,分析发现柴归颗粒在空肠和回肠、CUMs模型组与正常组中对化学成分的吸收种类相似。比较其在正常组和模型组中吸收程度,结果见表2。

经比较吸收成分在正常组与CUMs模型组大鼠的吸收峰面积,结果发现,两种机体状态下不同肠道吸收程度基本一致。但在空肠中,CUMs模型组较正常组E-丁烯基苯酞、洋川穹内酯H、芒柄花苷、阿魏酸、对羟基苯甲酸、5-羟甲基糠醛、Z-丁烯基苯酞和丁烯基苯酞吸收显著减少。而在回肠段,CUMs模型组与正常组的差异成分种类增多,差异倍数增加。芒柄花苷、柠檬酸、甘草查尔酮B、甘草皂苷G2、Macedonoside E、甘草皂苷A3、甘草皂苷E2、22-羟基甘草酸、22-β-乙酰基-甘草素、香叶木苷、橙皮苷、苯甲酰芍药苷、百里香新、蒙花苷、异甘草甘、正丁基苯酞、呋喃倍半萜类、甘草酸、没食子酰基芍药苷、柴胡皂苷c、E-藁本内酯、乌拉尔甘草皂苷B、甘草皂苷B2、绿原酸、白术内酯Ⅰ、Teradecylcitric acid、绿原酸同分异构体、异甘草素、倍半萜类和芍药新苷吸收CUMs模型组较正常组显著增加，芹糖甘草苷显著减少。

图1 柴归颗粒肠内溶液典型的色谱图(TICs)Figure 1 Typical chromatograms of Chaigui granules enteric solution

表1 柴归颗粒在回肠和空肠中的化学成分吸收

Table 1 Absorption of Chaigui granules in ileum and jejunum

No.保留时间(min)Mr化合物 来源 No.保留时间(min)Mr化合物 来源 11.30192.0264柠檬酸有机酸类2721.52418.1258异甘草甘黄酮类22.00170.0209没食子酸鞣质类2822.28286.0835甘草查尔酮B黄酮类33.47168.0417香草酸同分异构体有机酸类2923.12592.1786蒙花苷黄酮类44.11126.03115-羟甲基糠醛萜类3024.42188.0831E-丁烯基苯酞苯酞类55.49138.0311原儿茶醛有机酸类3125.06388.2455十四烷基柠檬酸有机酸类66.00544.1245芍药苷亚硫酸酯萜类3225.42584.1888苯甲酰芍药苷萜类77.10354.0945绿原酸有机酸类3325.49330.0734百里香新黄酮类87.20496.1575氧化芍药苷萜类3426.24984.4564甘草皂苷A3皂苷类97.33168.0417香草酸有机酸类3526.36300.0628香叶木素黄酮类107.73354.0945绿原酸同分异构体有机酸类3626.96880.408722-β-乙酰基-甘草素黄酮类1111.47480.1626白芍苷萜类3727.26838.3981甘草皂苷G2皂苷类1211.50480.1626芍药内酯苷萜类3827.44188.0831Z-丁烯基苯酞苯酞类1312.32164.0467反式桂皮酸有机酸类3927.82256.0730异甘草素黄酮类1413.84480.1626芍药苷萜类4028.50926.5233柴胡皂苷c皂苷类1516.02194.0573阿魏酸有机酸类4128.74820.3875甘草皂苷E2皂苷类1616.71138.0311对羟基苯甲酸酚酸类4229.25838.3981MacedonosideE皂苷类1717.66418.1258甘草甘黄酮类4330.55838.398122-羟基甘草酸皂苷类1817.67256.0730甘草素黄酮类4430.85822.4032甘草酸皂苷类1917.89550.1680芹糖甘草苷黄酮类4532.41808.4239甘草皂苷B2皂苷类2018.50632.1735没食子酰基芍药苷萜类4632.71780.4654柴胡皂苷a皂苷类2120.11610.1892橙皮苷黄酮类4732.74822.4032乌拉尔甘草皂苷B皂苷类2220.15608.1735香叶木苷黄酮类4832.98354.1461甘草苯并呋喃黄酮类2320.18224.1043洋川穹内酯H内酯类4933.12780.4654柴胡皂苷g皂苷类2420.87462.1520芍药新苷萜类5033.23192.1144洋川穹内酯A内酯类2521.14550.1680芹糖甘草苷或异构体黄酮类5133.67248.1406白术内酯Ⅲ内酯类2621.49430.1258芒柄花苷黄酮类5234.33822.47602″-O-乙酰化柴胡皂苷a皂苷类

续表1 柴归颗粒在回肠和空肠中的化学成分吸收

Table 1 Absorption of Chaigui granules in ileum and jejunum

No.保留时间(min)Mr化合物 来源 No.保留时间(min)Mr化合物 来源5334.43368.1254甘草香豆素香豆素类6237.67822.47603″-O-乙酰化柴胡皂苷d皂苷类5434.50822.47603″-O-乙酰化柴胡皂苷a皂苷类6337.78190.0988正丁基苯酞苯酞类5534.74822.47604″-O-乙酰化柴胡皂苷a皂苷类6437.97338.1512甘草查尔酮A黄酮类5634.84780.4654柴胡皂苷b1皂苷类6538.57780.4654柴胡皂苷d皂苷类5734.97822.47606″-O-乙酰化柴胡皂苷a皂苷类6640.15232.1457白术内酯Ⅰ内酯类5836.07190.0988E-藁本内酯内酯类6740.62230.1301呋喃倍半萜类萜类5936.99354.1079异黄酮甘草醇黄酮类6844.37230.1301白术内酯Ⅱ内酯类6037.21218.1665倍半萜类萜类6944.82188.0831丁烯基苯酞苯酞类6137.23822.47602″-O-乙酰化柴胡皂苷d皂苷类7046.71190.0988Z-藁本内酯内酯类

No.化合物 空肠(×106)正常组CUMs模型组回肠(×106)正常组CUMs模型组1柠檬酸 3730.000±298.600 4160.000±473.000 3620.000±577.300 6040.000±267.400∗∗∗2没食子酸 6740.000±346.300 6020.000±550.000 6540.000±862.800 7590.000±439.6003香草酸同分异构体 550.000±2.768 535.000±75.600 482.000±63.630 574.000±59.50045-羟甲基糠醛 7420.000±80.620 6500.000±312.900∗ 6600.000±70.760 6970.000±610.5005原儿茶醛 977.000±105.400 882.000±79.300 922.000±65.100 928.000±26.8306芍药苷亚硫酸酯 17.579±0.810 15.981±1.382 13.814±1.781 15.637±1.6937绿原酸 881.000±14.440 866.000±129.300 757.000±93.720 990.000±109.200∗8氧化芍药苷 286.000±4.221 299.000±50.760 246.000±29.640 308.000±34.2709香草酸 1820.000±67.780 1810.000±327.400 1630.000±209.00 2030.000±379.50010绿原酸同分异构体 390.000±6.972 392.000±65.530 335.000±43.960 446.000±59.220∗11白芍苷 115.000±2.020 121.000±19.890 98.595±6.328 117.000±13.02012芍药内酯苷 8710.000±56.150 8600.000±1112.000 7700.000±629.200 8950.000±864.60013反式桂皮酸 166.000±17.660 165.000±25.760 167.000±12.680 180.000±30.59014芍药苷28600.000±1306.00026300.000±3901.00024200.000±725.60028700.000±3971.00015阿魏酸 495.000±45.770 391.000±0.866∗∗ 232.000±22.410 286.000±42.57016对羟基苯甲酸 2350.000±29.140 2060.000±102.100∗∗ 2190.000±68.580 2150.000±160.90017甘草甘 3560.000±20.510 3210.000±388.600 3000.000±248.300 3790.000±221.700∗∗18甘草素 67.966±0.978 64.888±9.629 59.037±1.309 67.013±5.60719芹糖甘草苷或异构体 93.589±2.061 95.028±27.090 138.000±29.160 134.000±22.400∗20没食子酰基芍药苷 1500.000±28.690 1600.000±320.800 1310.000±203.400 1880.000±235.100∗21橙皮苷 45.859±0.528 42.224±7.423 36.078±3.526 50.091±4.684∗∗22香叶木苷 226.000±8.768 233.000±48.580 162.000±25.580 274.000±49.710∗∗23洋川穹内酯H 242.000±17.010 195.000±10.580∗∗ 232.000±6.797 224.000±3.91324芍药新苷 2490.000±122.100 2430.000±336.400 2170.000±197.300 2590.000±174.000∗25芹糖甘草苷或异构体 2720.000±26.620 2650.000±433.200 2310.000±278.300 2950.000±267.200

No.化合物 空肠(×106)正常组CUMs模型组回肠(×106)正常组CUMs模型组26芒柄花苷 254.000±1.693 208.000±15.670∗∗ 189.000±17.480 293.000±13.580∗∗∗27异甘草甘 167.000±13.460 159.000±42.650 145.000±34.940 245.000±36.990∗∗28甘草查尔酮B 250.000±35.130 286.000±85.470 10.395±3.131 452.000±140.200∗∗∗29蒙花苷1340.000±89.2501400.000±308.001030.000±164.8001650.000±223.800∗∗30E-丁烯基苯酞1050.000±16.320 892.000±1.054∗∗∗ 949.000±6.749 989.000±54.99031Teradecylcitricacid 148.000±4.060 156.000±45.290 122.000±15.920 196.000±40.090∗32苯甲酰芍药苷 936.000±56.540 889.000±143.700 795.000±53.9701060.000±85.120∗∗33百里香新 12.510±0.607 13.803±3.290 11.783±1.365 20.877±5.039∗∗34甘草皂苷A3 148.000±7.260 165.000±37.120 111.000±20.150 238.000±45.970∗∗35香叶木素 2.959±0.047 5.159±2.920 3.386±0.812 6.780±2.9943622-β-乙酰基-甘草素 70.647±0.640 79.091±20.300 52.237±7.793 114.000±25.150∗∗37甘草皂苷G2 342.000±2.030 329.000±41.210 266.000±31.010 554.000±104.800∗∗∗38Z-丁烯基苯酞1470.000±201.6001150.000±22.370∗1400.000±202.91210.000±92.47039异甘草素 53.657±3.697 178.000±40.400 8.729±7.158 187.000±159.400∗40柴胡皂苷c 55.387±2.210 67.973±20.870 42.313±5.720 74.098±13.270∗41甘草皂苷E2 35.708±0.437 40.111±10.240 24.782±6.558 60.000±12.170∗∗42MacedonosideE 242.000±4.255 286.000±66.210 182.000±19.630 398.000±78.990∗∗4322-羟基甘草酸 83.763±3.094 103.000±24.880 70.889±11.600 153.000±34.010∗∗44甘草酸1060.000±41.1601500.000±476.800 904.000±58.9001980.000±689.400∗45甘草皂苷B2 17.000±1.030 26.206±10.310 14.205±1.567 33.441±11.570∗46柴胡皂苷a 69.338±9.114 109.000±57.790 49.617±0.004 90.800±23.57047乌拉尔甘草皂苷B 191.000±12.580 305.000±113.700 158.000±14.400 371.000±130.200∗48甘草苯并呋喃 2.697±0.543 11.555±10.790 1.718±0.925 5.706±3.93849柴胡皂苷g 47.394±10.850 97.505±64.320 35.030±0.201 84.623±32.29050洋川穹内酯A 727.000±6.389 709.000±7.576 732.000±90.370 717.000±14.83051白术内酯Ⅲ 434.000±9.676 402.000±44.820 455.000±0.300 528.000±86.910522″-O-乙酰化柴胡皂苷a 9.556±0.803 14.774±8.089 6.650±0.592 14.143±4.91453甘草香豆素 3.505±1.340 18.509±17.820 1.637±0.312 7.992±4.405543″-O-乙酰化柴胡皂苷a 6.653±0.091 12.394±8.034 4.815±0.044 9.637±3.582554″-O-乙酰化柴胡皂苷a 14.448±3.979 30.050±18.210 11.442±0.822 26.935±7.72256柴胡皂苷b1 7.464±2.755 23.181±20.050 4.245±1.291 12.335±6.410576″-O-乙酰化柴胡皂苷a 17.383±5.331 40.614±28.890 12.319±0.149 28.816±12.59058E-藁本内酯 635.000±14.920 723.000±58.520 622.000±152.7001080.000±332.900∗59异黄酮甘草醇 7.371±3.133 44.760±43.040 5.093±1.645 16.326±9.82260倍半萜类 303.000±20.890 367.000±56.900 285.000±29.080 711.000±413.000∗612″-O-乙酰化柴胡皂苷d 11.936±2.047 26.037±17.560 8.522±0.109 19.760±6.845623″-O-乙酰化柴胡皂苷d 14.832±5.851 44.661±37.450 8.606±0.856 23.985±11.59063正丁基苯酞3180.000±30.9004820.000±1114.003360.000±919.3006860.000±2250.000∗64甘草查尔酮A 6.911±2.290 38.072±37.070 3.270±1.296 12.100±7.02665柴胡皂苷d 2.970±0.592 7.633±6.938 1.460±0.685 2.668±1.44266白术内酯Ⅰ 410.000±4.046 537.000±160.800 431.000±17.450 726.000±189.400∗67呋喃倍半萜类 390.000±3.585 821.000±358.400 450.000±95.4501070.000±310.700∗68白术内酯Ⅱ 71.876±3.002 162.000±96.390 89.289±4.423 176.000±55.03069丁烯基苯酞 6.982±0.448 20.927±13.210∗ 9.518±0.452 19.203±4.53870Z-藁本内酯 31.793±8.282 137.000±113.300 33.423±3.926 62.886±34.240

与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

3 讨论

柴归颗粒中小分子化学成分多数能够经肠道被吸收。经研究发现与空白组相比,在空肠中来源于当归,甘草和白术的8个化合物在空肠中吸收显著减少。在回肠中,模型组与对照组的差异成分种类增多,差异倍数增加,来源于甘草的15个,当归薄荷和白术的4个,白芍的3个和柴胡的1个化合物吸收显著增加。其中甘草查而酮B增加近21倍,异甘草素增加近43倍。

据报道甘草查而酮B和异甘草素是有效的抗抑郁活性物质。甘草查而酮B和异甘草素属于甘草黄酮类,甘草黄酮通过抗脂质过氧化作用,减少丙二醛生成起到抗抑郁作用[11],其含量的增加也可能与抗抑郁有关。

肠上皮细胞膜上分布着许多的转运体,造成正常组与模型组吸收差异的原因可能是上皮细胞的转运体发生变化,下一步将在细胞层面验证它们与外排转运蛋白的相互作用关系。