林海华,韩 平,余玉红,张绍敏,吕佳敏,张渊智#

(1深圳市盐田区人民医院消化内科,深圳 518000;2华中科技大学同济医学院附属同济医院消化内科;*通讯作者,E-mail:haihua19860913@163.com;#共同通讯作者,E-mail:29268395@qq.com)

原发性肝癌是一种常见的恶性肿瘤,目前全世界每年新增肝癌患者约70万,其中我国新增肝癌患者约占一半。肝癌早期易发生侵袭转移,是肝癌术后复发、疗效差的主要原因[1]。

正常的肝脏上皮细胞的存活,需要黏附于细胞外基质。如果肝细胞失去了与多种细胞基质的接触以及整合素蛋白传导的细胞外基质信号,就会导致其黏附性降低,最终出现细胞凋亡,这种由于细胞与细胞外基质和其他细胞失去接触而诱导的死亡形式被称为失巢凋亡(anoikis)[2]。失巢凋亡作为一种不同于普通凋亡的特殊的程序化细胞死亡方式,在机体发育、维持组织平衡、疾病的发生和肿瘤转移过程中发挥重要的作用。肿瘤细胞抗失巢凋亡的能力越强,其侵袭转移的能力就越高。因此从增加肿瘤细胞失巢凋亡这方面来干预肿瘤的侵袭转移,已受到越来越多的重视。

神经生长因子(nerve growth factor,NGF)是神经营养蛋白家族的一种糖蛋白,早期研究发现其与神经细胞的分化、生长、修复、再生有关。最近有研究表明其与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭及转移有关[3,4]。前期研究表明,NGF在肝癌组织相对于癌旁组织表达明显增高,且可能在肝癌的侵袭转移过程中发挥重要的作用[5]。本文利用低转移潜能的肝癌细胞HepG2研究NGF对抗失巢凋亡能力的影响,并探讨其受体TrkA和p75NTR在这个过程中发挥的作用,为肝癌的治疗提供新干预靶点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721由深圳市肝病研究所提供;PolyHEMA试剂、低熔点琼脂糖、CEP-701(TrkA受体抑制剂)等购自美国SIGMA公司;NGF质粒由加拿大McGill大学Barker教授惠赠;兔抗NGF多克隆抗体购自于美国Santa Cruz公司;转染试剂lipofectamine2000购自于Introvigen公司,Annexin-Ⅴ/FITC流式细胞检测试剂盒购自凯基生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 肝癌细胞HepG2、SMMC-7721培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,置于37 ℃含5%CO2的细胞培养箱中培养,待细胞融合度接近90%时弃去培养基,以磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后加入1 ml 0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化细胞按1-4传代。

1.2.2 Western blot检测HepG2和SMMC-7721细胞中NGF的表达情况 采用RIPA裂解细胞,低温离心机以15 000 r/min离心10 min后立即收集上清液,二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白含量。配制12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶,取50 μg总蛋白进行电泳,电泳完毕后将蛋白转印至硝酸纤维素膜(NC膜)上,用含5%牛血清白蛋白的TBST室温封闭1 h,加入兔抗NGF多克隆抗体(以1 ∶2 000稀释)后4 ℃孵育过夜,TBST洗3×10 min后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(1 ∶5 000稀释)室温孵育1 h,然后TBST洗5×10 min,再采用电化学法显影发光,X胶片曝光保存。按上述方法分别检测HepG2和SMMC-7721细胞中NGF的表达情况,以β-actin为内参照。

1.2.3 HepG2-pcDNA3-NGF稳定转染细胞株的建立 取处于对数生长期的HepG2细胞,胰酶消化后将细胞均匀铺于六孔板,待细胞融合度达到90%时开始转染。取250 μl无血清培养基与4.0 μg NGF质粒(pcDNA3-NGF)混匀,另取250 μl无血清培养基与10 μl的lipofectamine2000混匀,室温孵育5 min;将上述两种混合物混匀,室温放置20 min,形成DNA-lipofectamine2000复合物。用无血清培养基洗HepG2细胞两次,之后每孔内加入2 ml新的无血清培养基,再将上述混合物平均加入到每孔中,混合均匀。6 h后更换含10%胎牛血清的DMEM培养基,48 h后换用含G418的常规培养液继续培养。以后间隔2-4 d换液一次,持续28 d,获得细胞抗性克隆HepG2-pcDNA3-NGF(HepG2-NGF细胞)。待细胞高度融合后,转移至培养瓶中用含G418的培养液继续培养,以获得稳定转染细胞株。以同样的方法转染不含NGF的pcDNA3质粒至HepG2细胞(HepG2-control),作为阴性对照组。之后应用Western blot检测HepG2细胞转染NGF质粒后其NGF表达的变化。

1.2.4 软琼脂集落实验 将1.2%的琼脂糖与2×DMEM培养基(20%胎牛血清)等体积混合,制成0.6%的底层琼脂凝胶,在24孔板每孔内加入800 μl,置于室温使琼脂胶凝固后备用。将0.6%的琼脂糖与2×DMEM培养基等体积混合,制成0.3%的上层琼脂凝胶。取对数生长期细胞,0.25%胰酶消化后计数,调整细胞浓度为104个/ml。每孔加入100 μl的单细胞悬液(约1 000个细胞/孔),将其混匀,待凝固后将培养板置于37 ℃含5% CO2的细胞培养箱内培养2周,结晶紫染色后拍照。

1.2.5 失巢凋亡培养模型的建立 参照文献构建细胞失巢凋亡培养的模型[6]。阴离子聚合物聚甲基丙烯酸羟乙基酯(polyHEMA)铺于平皿底部,细胞无法贴壁生长,借此模拟细胞失巢样生长状态。取10 g/L的polyHEMA无水乙醇溶液2 ml,铺于60 mm的培养皿中,紫外灯照射消毒,室温干燥直至无水乙醇全部挥发形成一层膜后,再次重复上述步骤。将1×106细胞接种于培养皿中,在37 ℃含5% CO2的细胞培养箱中培养24 h后用于实验观察。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 收集下列状态下的细胞:①贴壁生长24 h的HepG2细胞;②悬浮生长24 h的HepG2细胞;③悬浮生长24 h的HepG2-control细胞;④悬浮生长24 h的HepG2-NGF细胞;⑤悬浮生长24 h的HepG2-NGF细胞+CEP-701(浓度10 mg/L);⑥悬浮生长24 h的HepG2-NGF细胞+p75NTR蛋白(浓度500 ng/ml)。调整约105个细胞/EP管,离心2 000 r/min×5 min,弃上清,加入200 μl PBS重悬细胞,重复上述的步骤两次,然后每管加入200 μl结合缓冲液,再加入FITC 5 μl/管,混匀后避光反应10 min,再加入PI(propidium,碘化吡啶)5 μl/管混匀,室温反应10 min,1 h内用流式细胞检测仪检测细胞凋亡情况。

1.2.7 统计学方法 数据以均数±标准差表示,应用SPSS16.0软件对结果进行分析,两组间数据比较采用t检验，多组间数据比较应用one way ANOVA检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HepG2、SMMC-7721细胞中NGF的表达情况

Western blot检测NGF在具低转移潜能的HepG2细胞和具高转移潜能的SMMC-7721细胞中的表达。NGF在HepG2细胞中的表达明显低于在SMMC-7721细胞中的表达(见图1),因此我们选择HepG2细胞为载体研究NGF的作用。pcDNA3-NGF质粒稳定转染到HepG2细胞后,NGF蛋白表达水平明显增高,稳定转染质粒pcDNA3-NGF后HepG2细胞中NGF蛋白表达量大约是对照组细胞的5倍(见图1)。

图1 NGF在肝癌细胞HepG2、SMMC-7721中的表达及NGF质粒转染入HepG2细胞前后的表达变化Figure 1 The expression of NGF in HepG2 cells and SMMC-7721cells and its change in HepG2 cells after transfection

2.2 NGF质粒转染对HepG2细胞集落形成的影响

HepG2、HepG2-control、HepG2-NGF细胞在软琼脂中生长7 d均可逐渐形成集落,观察各组细胞在14 d后每平方厘米形成的直径大于75 μm的集落数量,HepG2、HepG2-control生长14 d后每平方厘米的细胞集落数分别为(26±4)个和(29±5)个,两组之间没有明显差异(t-test,P>0.05);稳定转染NGF的HepG2细胞(HepG2-NGF)和具有高转移潜能、高表达NGF的SMMC-7721细胞在生长14 d后可形成集落数分别为(78±7)个/cm2和(63±6)个/cm2(每组实验均重复3次,每次实验测量10个单位面积的集落数),明显多于HepG2细胞和HepG2-control细胞生长14 d细胞集落数(见图2),差异有统计学意义(one way ANOVA,P<0.05)。证明NGF能增加HepG2细胞集落形成的能力。

2.3 NGF对HepG2细胞在失巢培养模型中生长的影响

观察不同细胞在贴壁状态和失巢的悬浮状态下生长形态的变化。未转染的HepG2细胞和稳定转染NGF的HepG2-NGF细胞均可在贴壁状态下正常生长(见图3A,B)。在失巢培养模型的悬浮状态下,HepG2细胞可以聚集成团生长,并有部分散在的细胞(见图3C),说明该细胞具有一定的抗失巢凋亡能力。稳定转染NGF的HepG2-NGF细胞在悬浮状态下大部分能聚集成直径更大的团,且仅有少许散在的细胞(见图3D),说明NGF能增加HepG2细胞的抗失巢凋亡能力。

与HepG2、HepG2-control细胞相比较，*P<0.05图2 各类细胞悬浮生长14 d后集落数的对比Figure 2 The quantity of cell colony in different cells at 14 d in suspension culture models

图3 HepG2、HepG2-NGF细胞在贴壁、悬浮状态下的生长情况Figure 3 The growth situation of HepG2 and HepG2-NGF cells in attached and suspension culture models

2.4 NGF对HepG2细胞失巢凋亡的影响

利用流式细胞仪、Annexin-Ⅴ/FITC试剂盒检测各组细胞的凋亡情况,每组实验均重复3次。HepG2细胞贴壁生长24 h后的早期细胞凋亡比例为3.78%±0.33%,HepG2细胞悬浮生长24 h后的早期凋亡比例为4.63%±0.38%,稍微高于HepG2细胞贴壁生长的早期凋亡比例,但差异无统计学意义(P>0.05,见图4),说明HepG2细胞本身具有一定的抗失巢凋亡能力。当HepG2细胞稳定转染NGF质粒后,HepG2-NGF细胞悬浮生长24 h的早期凋亡比例为1.43%±0.18%,明显低于HepG2细胞和只转染pcDNA3的对照细胞HepG2-control(凋亡比例5.42%±0.47%),差异有统计学意义(P<0.05,见图4),说明NGF能增加HepG2细胞的抗失巢凋亡能力。

2.5 NGF增加HepG2细胞抗失巢凋亡能力与其受体的关系

为研究TrkA受体及p75NTR受体在NGF增强HepG2细胞抗失巢凋亡能力中的作用,我们选用TrkA受体拮抗剂CEP-701及p75NTR蛋白研究他们对HepG2细胞失巢凋亡的影响。在悬浮生长的HepG2-NGF细胞中加入10 mg/L的CEP-701或500 ng/ml的p75NTR蛋白,24 h后流式细胞仪检测细胞的凋亡比例,每组实验均重复3次。结果发现,加入CEP-701或p75NTR蛋白后,HepG2-NGF细胞悬浮生长24 h的早期凋亡比例分别为12.37%±1.74%和15.48%±2.36%,明显高于不加CEP-701或p75NTR蛋白的HepG2-NGF细胞凋亡比例,差异有统计学意义(P<0.05,见图4)。这说明CEP-701或p75NTR蛋白可以降低NGF的抗肝癌细胞失巢凋亡的能力,提示NGF可能通过与TrkA受体结合发挥其抗肝癌细胞失巢凋亡作用,而与p75NTR受体的结合可以诱导肝癌细胞的凋亡。

与HepG2、HepG2-control细胞悬浮生长24 h比较，*P<0.05；与HepG2-NGF细胞相比，#P<0.05图4 各种细胞的早期凋亡比例比较Figure 4 The proportion of early apoptosis in different cells

3 讨论

目前,手术切除仍是原发性肝癌的主要治疗手段,但术后肿瘤发生复发转移,是造成肝癌患者预后差的主要原因[7]。具有抗失巢凋亡能力的肿瘤细胞能在游离状态下长期存活,导致肝癌患者在切除原发病灶后仍易发生肝内外转移。

神经生长因子(NGF)是神经营养蛋白家族中的一种与神经细胞分化生长有关的细胞因子,有研究显示其与多种肿瘤细胞的侵袭转移有关[8]。NGF的受体有两种:一种为TrkA,为高亲和性受体,它是由原癌基因trk编码的一种酪氨酸激酶受体,能特异性地与NGF结合,激活酪氨酸激酶信号传递系统,从而启动细胞活性,产生生物效应,该途径可能与调节基因表达、诱导细胞分化有关。另一种为糖蛋白受体,简称p75NTR,为低亲和力受体,除了与NGF结合外,还可与其他神经营养蛋白结合,是最先克隆鉴定的神经营养素的受体。NGF通过其受体p75NTR在肿瘤细胞凋亡和侵袭等方面发挥重要的调节作用[3,9]。

以前的研究表明,肝癌组织中NGF表达明显高于癌旁组织,NGF可以促进肝癌细胞侵袭转移[5];本实验也证实了高转移潜能的SMMC-7721细胞中NGF的表达明显高于低转移潜能的HepG2细胞(见图1)。癌细胞的侵袭转移潜能与其抗失巢凋亡能力呈正相关,因此推测NGF高表达能增加肝癌细胞的抗失巢凋亡能力。本实验选用低NGF表达、低转移潜能的HepG2细胞为载体研究NGF的作用,研究发现,转染NGF质粒的HepG2-NGF细胞在软琼脂集落实验中形成的集落数量明显多于HepG2细胞(见图2),在悬浮培养模型中细胞早期凋亡率降低(见图4),证明NGF的表达越高,其抗失巢凋亡的能力越强,这种能力可能使NGF在肝癌的侵袭转移过程中发挥着重要作用。

Kishibi等[10]和Yoshihiko等[11]研究发现与肝硬化,肝炎组织相比,肝癌组织中除了NGF的表达明显增多外,TrKA受体表达明显高于癌旁组织;TrKA受体拮抗剂能对抗肿瘤细胞的侵袭转移[12],而无论是在肝细胞中,还是在肝癌细胞中都不能检测到p75NTR受体的表达[11]。因此本研究推测,增加NGF的p75NTR受体或抑制TrKA受体均可促进肝癌细胞的凋亡,对抗肿瘤细胞的侵袭转移。向HepG2-NGF细胞中加入p75NTR蛋白或TrKA受体抑制剂后均发现它在悬浮培养模型中的失巢凋亡率明显增加,甚至高于未转染的HepG2细胞,说明NGF可能通过与TrkA受体结合发挥其抗肝癌细胞失巢凋亡作用,而其受体p75NTR可能在这个过程中发挥相反的作用,NGF与p75NTR受体的结合可以诱导肝癌细胞的凋亡。

恶性肿瘤细胞在转移到异位的起始阶段,都具备明显的抗失巢凋亡能力。肝癌细胞从肿瘤部位脱落后不发生凋亡,而是在起始阶段就发生了抗失巢凋亡,继续在循环系统中生存,迁移到周围组织继续生长。本研究发现NGF在这个过程中可以增强肝癌细胞的抗失巢凋亡的能力,为进一步探讨肝癌细胞的抗失巢凋亡的机制奠定了基础,而且有望为肝癌的治疗开辟NGF这个新的干预靶点。