刘伟华,尹春燕,常 明

(1西安市第一医院儿科,西安 710004;2西安交通大学第二附属医院儿科;3安康市人民医院儿科;*通讯作者,E-mail:286896173@qq.com)

肥胖是一种由多种因素引起的慢性代谢紊乱性疾病,体脂占体重的百分比异常增高,沉积脂肪过多所致。白色脂肪组织占正常成人体重约20%,其在肥胖人群中所占比例显著升高[1]。白色脂肪组织过度蓄积是引起肥胖及一系列代谢紊乱的根源。脂肪生成是指前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的过程[2],白色脂肪前体细胞向成熟细胞的分化过程受到CCAAT-增强结合蛋白β/α(C/EBP-β/α)-过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)信号通路调控[3,4]。长链非编码RNA(lncRNA)通过对邻近或远端基因的调控影响而发挥信号通路的调节作用,并参与多种疾病,如癌症、心血管疾病和代谢紊乱等的发生及进展[5],然而lncRNA在脂肪生成中的调控作用仍不十分清楚。本研究旨在分析脂肪生成过程中lncRNA表达谱,并初步探讨lncRNA Gm15290在脂肪生成中的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4周龄雄性野生型(WT)C57BL/6J小鼠4只和4周龄ob/ob小鼠4只,购自于西安交通大学医学院动物实验中心。颈脱位处死小鼠,采集腹股沟白色脂肪组织(IWAT)和附睾白色脂肪组织(EAT),清洗后立即冷冻于液氮中备用。

1.2 主要试剂

Trizol试剂购自美国Invitrogen公司;RNeasy Mini Kit购自德国Qiagen公司;lncRNA芯片购自美国Arraystar公司;DMEM-F12培养基购自美国Gibco公司;胎牛血清购自美国Gibco公司;油红O购自美国Sigma公司;脂质体3000购自上海吉玛公司;PPARγ抗体、aP2抗体、抗C/EBPα抗体购自英国Abcam公司;逆转录试剂盒、PCR扩增试剂盒购自中国的宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 lncRNA芯片分析

用研钵研磨冷冻脂肪组织并用Trizol试剂消化,按照RNeasy Mini Kit说明方法提取总RNA。测定RNA样品的浓度和纯度后,将白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织的RNA以相等量混合加入小鼠lncRNA芯片进行检测。在标准化前提取原始数据。使用GeneSpring GX软件处理数据。当表达差异超过2倍时,说明WT小鼠和ob/ob小鼠lncRNA之间存在差异。通过Gene Ontology和DAVID数据库进行GO生物功能和基于KEGG的pathway富集分析,以P<0.05表示具有统计学意义的信号通路。

1.4 前脂肪细胞的原代培养及转染

处死4周龄的WT小鼠,取小鼠腹股沟白色脂肪组织,去除任何可见的血块和结缔组织,用PBS冲洗,切割成5 mm3小块。用1 mg/ml胶原酶在37 ℃水浴中消化脂肪组织45 min左右。消化好的组织液通过400目筛网过滤,悬浮液以1 000 r/min离心5 min,细胞用无血清培养基洗涤,再离心,悬浮于DMEM-F12培养基中,之后将细胞接种到35 mm培养瓶中。培养18 h后,去除非贴壁细胞,更换培养基。第3代细胞用于细胞转染和脂肪分化实验。

将1×106个/孔的原代细胞接种于6孔板。当细胞汇合达70%时,按照说明书用脂质体3 000转染试剂将pAd-Gm15290或Gm 15290 siRNA转染进细胞,分别在第0,2,4,6,8天,用Western blot检测成脂基因的蛋白水平。具体分组如下:①空白对照组、空载体组(vector组)、pAd-Gm15290(0.1,0.5,1.0 μg/ml);②空白对照组、正常对照组(scramble组)、Gm 15290 siRNA(20,40,80 nmol/L)。

1.5 鸡尾酒法诱导分化脂肪细胞

以8×104/孔将原代前脂肪细胞铺于6孔板,当细胞汇合度达100%后继续培养3 d。加入诱导A液(10%FBS、DMEM、IBMX、DEX、Insulin)诱导48 h,再加入诱导B液(10%FBS、DMEM、Insulin)诱导48 h,需要2 d换1次液,共刺激12 d。

1.6 油红O染色

为了观察脂肪细胞是否诱导成功,在脂肪细胞诱导分化第8天,用PBS洗涤两次,用4%的多聚甲醛溶液固定40 min,加入改良的油红O染色液,染色8 min,用纯净水冲洗2次,光学显微镜观察细胞质中脂滴的聚集情况。

1.7 Western blot检测PPARγ、aP2及C/EBPα蛋白表达

脂肪细胞用1%PMSF的RIPA缓冲液溶解。用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质裂解液,将样品转移到PDVF膜上,用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭2 h。用PPARγ抗体(1 ∶200)、aP2抗体(1 ∶300)、抗C/EBPα抗体(1 ∶500)在4 ℃过夜,用合适的辣根过氧化物酶结合IgG(1 ∶2 000,ABCAM)在室温下孵育1 h。用增强化学发光试剂盒显影,并用Quantity One软件进行分析。

1.8 实时荧光定量PCR(qPCR)检测lncRNA Gm 15290的表达

采用Trizol试剂提取脂肪组织中的总RNA,逆转录试剂盒进行cDNA第一链合成,严格按照试剂盒说明书进行操作。采用25 μl反应体系进行PCR扩增,扩增条件为:95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 25 s,共35个循环,72 ℃ 10 min。扩增结束后采用iCycler iQTMOptical System进行数据分析。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 lncRNA Gm 15290在ob/ob小鼠的白色脂肪组织中显著上调

采用小鼠lncRNA芯片检测WT小鼠和ob/ob小鼠白色脂肪组织的lncRNA的差异表达谱,结果表明在WT小鼠和ob/ob小鼠之间有2 246个lncRNAs存在差异表达。利用生物信息学分析差异表达的lncRNA的分类、长度分布和染色体分布等一些特征,结果发现在这2 246个差异表达lncRNA中,53.6%(1 204个)为外显子lncRNA,19.4%(436个)为内含子lncRNA,27.0%(606个)为反义lncRNA(见图1A)。差异表达的lncRNA长度分布比较均匀,长度<1 000 nt的lncRNA为337,长度为1 000-2 000 nt的lncRNA为411,长度>20 000 nt的lncRNA为437个(见图1B)。差异表达的lncRNA分布主要集中在1号染色体上,其余的lncRNA相对均匀地分布在其他染色体上(见图1C)。采用GO和KEGG分析发现,在这些差异显著表达的lncRNA中,lncRNA Gm 15290与代谢和细胞生物合成过程有关,可能参与脂肪合成。qPCR分析结果表明,ob/ob小鼠白色脂肪组织的lncRNA Gm 15290水平约为WT小鼠的两倍(见图1D)。这表明lncRNA Gm 15290可能在肥胖脂肪组织生成中具有一定作用。

图1 lncRNA在WT小鼠和ob/ob小鼠白色脂肪组织中差异表达Figure 1 Differential expression of lncRNA in white adipose tissue of WT mice and ob/ob mice

2.2 lncRNA Gm 15290可以促进小鼠原代脂肪细胞脂肪生成

pAd-Gm15290过表达与Gm15290 siRNA敲除效率见图2,采用0.5 μg/ml pAd-Gm15290和40 nmol/L lncRNA Gm 15290 siRNA进行后续研究。实验结果发现lncRNA Gm15290过表达可以显著促进脂肪细胞分化,而Gm15290基因敲除明显抑制脂肪细胞分化。lncRNAGm15290主要通过促进包括PPARγ、早期成脂C/EBPα和晚期脂肪分子aP2的表达促进脂肪生成(见图3)。油红O染色显示,pAd-Gm15290转染第8天脂肪细胞内可见大量脂滴蓄积,而Gm15290 siRNA转染后脂肪细胞内脂质蓄积较少(见图4)。这些体外实验表明,lncRNA Gm15290在小鼠脂肪细胞成脂中发挥正调节作用。

与control比较,*P<0.05;与0.1 μg/ml or 20 nmol/L比较,#P<0.05图2 pAd-Gm15290过表达与Gm15290 siRNA敲除效率 (n=8)Figure 2 Overexpression of pAd-Gm15290 and knockout efficiency of Gm15290 siRNA (n=8)

图3 pAd-Gm15290及Gm15290 siRNA对脂肪细胞PPARγ、C/EBPα和aP2表达的影响Figure 3 Effects of pAd-Gm15290 and Gm15290 siRNA on the expression of PPARγ, C/EBPα and aP2 in adipocytes

图4 第8天脂肪细胞脂质堆积的油红O染色分析Figure 4 Oil red O staining analysis for the lipid accumulation in the adipocytes at day 8

3 讨论

越来越多的研究表明,lncRNA具有种属特异性及广泛的生物学功能,然而目前对lncRNA在人类脂肪组合成中的调节功能及其在其他代谢性疾病中的作用仍然不是很清楚[6]。本研究采用lncRNA芯片技术成功地分析了lncRNA在WT小鼠和ob/ob小鼠白色脂肪组织中的差异表达谱。根据基因芯片数据,结果提示共有2 246个lncRNA存在差异表达,说明有许多lncRNAs可能参与了肥胖的发生及脂代谢。为了进一步明确这些lncRNA的生物学功能,本研究采用GO分析和KEGG分析对其功能进行研究。GO分析结果提示涉及差异表达的lncRNA的主要生物学过程包括“炎症反应”“细胞因子产生”“脂质代谢过程”“葡萄糖代谢过程”和“有机酸代谢过程”。KEGG分析显示,与lncRNA相关的基因主要涉及“破骨细胞分化”“糖尿病”“脂肪酸代谢”“丙酮酸代谢”和“不饱和脂肪酸的生物合成”。此外,本研究结果还提示一些富集的代谢通路,比如碳代谢和疟疾,这些通路在肥胖发展中的作用至今还没有被研究过,需要进一步研究。lncRNA通过多种机制发挥生物学功能,包括与非编码RNAs或基因的结合、染色质修饰、剪接和翻译[7,8]。此外,越来越多的证据表明lncRNA可能通过相互作用的网络在脂肪组织中发挥关键的调节作用。

lncRNA Gm 15290最早是在2014年通过对遗传性癫痫小鼠脑内差异基因表达的高通量测序发现的[9]。在此之后,对小鼠转录因子和非编码RNA的综合分析发现lncRNA Gm 15290在闭塞性毛细支气管炎中显著上调[10]。最近一项关于非小细胞肺癌的研究,也是目前唯一关于lncRNA Gm 15290的生物学功能研究,实验表明lncRNA Gm 15290通过海绵样吸附肿瘤抑制因子miR-615-5p发挥促进肿瘤生成的作用[11]。然而,目前lncRNA Gm 15290在肥胖及代谢疾病中的作用仍然不清楚。在本研究的芯片分析中,结果提示lncRNA Gm 15290是ob/ob小鼠白色脂肪组织上调最显著的lncRNAs之一。通过对小鼠原代脂肪细胞过表达和沉默处理,结果提示lncRNA Gm 15290在体外对脂肪生成和体内脂肪沉积均有正调控作用。此外研究结果提示lncRNA Gm 15290可以促进PPARγ、C/EBPα和aP2的表达促进脂肪生成。核激素受体核PPARγ家族有3个成员:α、γ和δ,其中,PPARγ是唯一在脂肪组织中高度表达的基因,并已被证明在促进脂肪程序性生成过程中发挥着核心作用。PPARγ在前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化过程的早期表达中异位表达PPARγ和激活配体可以促进非脂肪成纤维细胞转化为脂肪间充质细胞并诱导完整的成脂基因的性程序表达,研究结果提示lncRNA Gm 15290可以促进PPARγ的表达。C/EBPα在脂肪细胞分化过程中表达相对较晚,它的表达在PPARγ之后,但是在脂肪细胞分化完成时许多特异性酶和蛋白质合成之前。C/EBPα在成纤维细胞中的高表达同样可以促使其转化为脂肪细胞[12]。aP2(AFBP4)最早是在白色脂肪组织及成熟脂肪细胞中检测出的。FABP4在脂肪细胞中高度表达,约占脂肪组织中所有可溶性蛋白的1%。FABP4主要在脂肪细胞分化晚期表达,主要与脂滴合成有关,并受到PPARγ激动剂、胰岛素、地塞米松和过氧化物酶体激活受体(PPAR)的调控[12]。而lncRNA Gm 15290均可促进上述脂肪细胞分化相关基因的表达,说明lncRNA Gm 15290在整个脂肪细胞分化过程中均发挥正向调控作用。

综上所述,本研究结果提示多种lncRNAs在WT小鼠和ob/ob小鼠白色脂肪组织中的差异表达,lncRNA Gm 15290在ob/ob小鼠白色脂肪组织明显上调,进一步研究结果提示lncRNA Gm 15290可以促进PPARγ、C/EBPα和aP2的表达进而促进脂肪生成。但本研究仅是体外细胞研究,为了明确lncRNA Gm 15290的具体作用机制,需要进一步进行体内实验研究。