李小玲，赵义兰，华智锐

(商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛726000)

美容杜鹃(Rhndodendroncalophytum)属于杜鹃花科、杜鹃花属(RhododendronLinn)的植物，具有较高的园林观赏及应用价值。随着城市化进程的推进及旅游业的发展，人类不合理的采挖导致杜鹃花资源破坏及流失，加之杜鹃花生长缓慢，常用的扦插、嫁接等无性繁殖方式成苗率不高[1]，且都会受到诸如季节气候、母株材料等很多条件的影响，难以扩大规模、进行商品化操作[2]。因此，种子繁殖成为杜鹃花规模化栽培及繁育新品种的主要方法，但杜鹃种子极为细小，萌发率又低，很难进行大规模栽培[3]，而人工种子技术作为一门新兴技术为杜鹃花的栽培提供了一条新途径。

人工种子又称合成种子，是指将离体培养产生的胚状体、不定芽及分生组织包埋在具有一定营养成分及保护作用的人工种皮内，在人为提供的培养条件下能够发芽成苗的颗粒体[4]。近年来,人工种子的包埋繁殖体已不仅仅局限于体细胞胚，即人工种子的制作已从单一的体细胞胚发展到能够发育成完整植株的分生组织，如愈伤组织、原球茎、块茎、不定芽、腋芽等[5-6]，所以当采用分生组织作为包埋繁殖体制作人工种子获得成功后便迅速成为热点，也使得人工种子的研究从模式植物转向具有重要经济价值的粮食作物和药用植物。目前对杜鹃人工种子的制作研究较少，本试验以美容杜鹃腋芽为材料，研究了人工种子制作方法及萌发条件，旨在为美容杜鹃人工种子的研究提供理论依据，为杜鹃的规模化生产提供新途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

美容杜鹃(Rhndodendroncalophytum)腋芽于2019年4月上旬采自商洛市镇安县国家木王林场海拔1500 m左右的杜鹃花景区。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理 选择美容杜鹃带腋芽茎段，经流水冲洗数小时，后置于超净工作台上用75%酒精消毒30 s，用无菌水冲洗2～3次，再用0.1% HgCl2消毒8 min，最后用无菌水冲洗3～5次，将消毒好的茎段切成2～4 mm作为人工种子包埋繁殖体备用。

1.2.2 人工种子制作 人工种子制作方法采用滴注法，具体操作步骤如下：将切好的外植体小段悬浮于半凝胶状态的2%～4%海藻酸钠溶液中，充分摇匀混合5～8 min后，用胶头滴管吸取单个茎段，滴于2% CaCl2溶液中进行离子反应，即得人工种子。

1.2.3 人工种子萌发 捞出人工种子，用无菌水冲洗2～3次，用滤纸吸干表面水分，分别播种于不加激素的MS培养基上，加有激素的MS培养基和铺有用无菌水浸润滤纸的培养皿中。培养温度设为(25±1) ℃，光照时间为12 h/d，光照强度为1000～2000 lx；20 d后观察人工种子萌发率。

以上所有美容杜鹃人工种子萌发试验中，以突破种皮2 mm视为萌发，萌发率=萌发的人工种子数/播种的人工种子总数×100%。

1.2.4 不同人工胚乳及人工种皮配方对人工种子萌发的影响 选用1/2 MS液体培养基与不同浓度激素配比(0.2∶0.1、 0.3∶0.1、0.4∶0.1激素单位为mg/L)NAA∶GA3(A)及3%、4%、5%的海藻酸钠(B)，与2%壳聚糖组成人工胚乳配方；与0～0.2 mg/L苯甲酸钠(C)、0～0.2 mg/L多菌灵(D)及 2%、8%、10%的CaCl2(E)组成种皮配方；以10、15、20 min的不同离子反应时间进行5因素3水平的正交试验(表1)。将制作好的人工种子播于MS培养基中，每个处理为10粒，重复3次。放于无菌培养室培养，温度设为(25±1) ℃，光照强度为1000～2000 lx，光照时间12 h/d；20 d后统计不同人工胚乳组分下人工种子的萌发数。

表1 正交试验因素L18(35)水平表

1.2.5 不同海藻酸钠浓度及离子交换时间对人工种子成形的影响 将3%、4%、5%的海藻酸钠溶液分别与2%、8%、10% CaCl2溶液进行离子交换反应，反应时间设10、15、20 min，观察人工种子成形情况。

1.2.6 不同萌发基质对人工种子萌发及成苗的影响 将制作好的人工种子分别播种于不加激素的MS培养基和加有激素的MS培养基(0.2 mg/L NAA，0.1 mg/L GA3)以及用无菌水浸润滤纸的培养皿和用1/2 MS浸润滤纸的培养皿，每个处理为10粒，重复3次。放于无菌培养室培养，温度设为(25±1) ℃，光照时间设每天12 h，光照强度设1000～2000 lx；20 d后统计人工种子萌发率及成苗率。

2 结果与分析

2.1 海藻酸钠浓度以及离子交换时间对人工种子成形的影响

经预试验发现2%海藻酸钠+2% CaCl2种子成形不理想，表现为种子颗粒不均匀，看似成形，实际捞出即破，无弹性，种子成形时间长，易粘连且易碎(图1a～1c)。故增加海藻酸钠浓度到5%，并将CaCl2浓度提高到8%、10%、15%，并根据孙筱筠等[7]的研究结果，将人工种子胚乳成分稍加完善，以添加1.5%的可溶性淀粉来增加人工种子透气性，并且对一次成形不好的人工种子进行二次包埋。经调整后发现15%的CaCl2浓度太高，种子硬度大，无弹性且透明度低(图1d～1f)因此舍弃这两个浓度，后续试验按照海藻酸钠浓度2%～5%，CaCl2浓度为2%、8%、10%来进行。由表2可知不同海藻酸钠浓度和CaCl2浓度及离子反应时间，均对人工种子成形有较大影响，当海藻酸钠浓度过低时，人工种子不能成球形且形状不规则，较软，塌扁并易粘连，无弹性，种子成形时间长；而当海藻酸钠浓度过高时，虽然缩短了成形时间，但人工种子拖尾现象严重，硬度大且透明度低，浑浊[8,9]。本试验结果表明，4%海藻酸钠溶液在2% CaCl2溶液中反应15 min和3%海藻酸钠溶液在2%、8% CaCl2溶液中反应20 min形成的人工种子呈透明状，颗粒均匀，富有弹性(图1g～1i)。

表2 不同海藻酸钠浓度及离子交换时间对人工种子成形的影响

a、b、c分别为2%海藻酸钠溶液在2% CaCl2溶液中反应10、15、20 min；d、e、f分别为5%海藻酸钠溶液在2% CaCl2溶液中反应10、15、20 min；g、h、i分别为4%海藻酸钠溶液在2% CaCl2溶液中反应15 min，3%海藻酸钠溶液在2% CaCl2溶液中反应20 min，3%海藻酸钠溶液在8% CaCl2溶液中反应20 min。

图1 海藻酸钠浓度以及离子交换时间对人工种子成形的影响

2.2 不同人工胚乳及人工种皮配方对人工种子萌发的影响

以1/2 MS液体培养基作为包埋溶剂，选用3水平5因素的正交试验L18(35)(表1)，将不同的人工胚乳成分与不同的人工种皮成分进行离子反应10、15、20 min。由表3[10]中的极差分析可知：5个因素对于美容杜鹃人工种子萌发的影响程度依次为B>E>D>C>A，即海藻酸钠>CaCl2>多菌灵>苯甲酸钠>激素比(NAA∶GA3)；海藻酸钠、CaCl2、多菌灵对人工种子萌发率的影响程度均达到显著水平，其次是苯甲酸钠、NAA与GA3； NAA与GA3的激素配比对人工种子萌发影响最小；但根据后期萌发结果可知激素对人工种子萌发起到促进作用，但促进效果不显著；最优组合为A2B2C3D3E1，这与本次试验结果一致。

综合分析，最佳人工胚乳与种皮配方为4%海藻酸钠+0.2 mg/L多菌灵+0.2 mg/L苯甲酸钠+NAA∶GA3(0.3∶0.1)+2% CaCl2；经后期萌发结果可知该组合配方制作的人工种子萌发率达87%以上。

表3 正交因素对人工种子萌发分析表

2.3 不同萌发基质对人工种子萌发的影响

本试验将制作好的人工种子分别播于普通MS培养基，加有激素的MS培养基(0.2 mg/L NAA，0.1 mg/L GA3)以及用无菌水浸润滤纸的培养皿和用1/2 MS浸润滤纸的培养皿中。结果表明：用1/2 MS浸润滤纸的培养皿中的人工种子在14 d左右逐渐出现污染情况，种子无失水，20 d时的萌发率达31%；而用无菌水浸润滤纸作为对照培养的培养皿中的人工种子，在12 d左右种子则逐渐失水变干，但并无污染情况，且20 d时的萌发率为20.3%(图2a～2b)；经二次包埋的人工种子虽也会失水，但失水情况较一次包埋减轻许多，在15 d左右时种子逐渐失水，并且萌发率较一次包埋有所提高，说明二次包埋有效地降低了种子失水率，提高了萌发率；培养基组的人工种子则并无太大差异，加有激素的MS培养基中的人工种子在10 d左右开始萌发，20 d时萌发率达87%，而普通MS培养基中的人工种子萌发相对较慢，在12 d时逐渐开始萌发，20 d时的萌发率达84%(图2c～2d)。对4种不同萌发基质的萌发效果进行方差分析(表4)可知，美容杜鹃人工种子在加激素的培养基中萌发率显著高于其它处理组，其次是不加激素的MS培养基，而用1/2 MS液体浸润滤纸的培养皿中的人工种子萌发效果最不显著；加激素的培养基是人工种子的最适萌发基质。

3 讨论

本试验采用带腋芽茎段制作人工种子有许多优点：可避免体细胞胚胎发生的变异，且取材容易，成本低[11]；海藻酸钠凝胶包埋系统具有无毒、使用方便、易成胶、价格低廉等优点[12,13]。本次试验利用海藻酸钠作为包埋基质对美容杜鹃进行了包埋处理，得出人工胚乳的最佳制作条件为4%海藻酸钠与2% CaCl2水溶液离子反应15 min，形成的人工种子颗粒均匀，软硬适中，富有弹性。这与张明生等[14]的研究结果一致，但与已报道的张建彬等[15]的大花蕙兰类原球茎的人工种子的制作中海藻酸钠的浓度有所差异。同时从本次试验还可看出海藻酸钠作为包埋系统的一些缺点，如：保水性较差，易使营养物质流失，同时胶粒在空气中容易失水变干，致使人工种子在后期的培养中萌发受阻，这与秦自清等[16-18]的研究结果一致。孙筱筠等[7]研究发现在海藻酸钠凝胶系统中加入淀粉形成混合包埋基质，不仅改善了单一海藻酸钠凝胶系统所造成的保水性差的问题，同时也提高了人工种子的萌发率。本试验吸取前人的经验，在人工胚乳成分中添加了可溶性淀粉，结果表明加入淀粉后能有效增加人工胚乳的保水性并提高人工种子的萌发率；分析原因可能是淀粉分子中疏松的多孔结构改变了海藻酸钠的紧密结构，增加了海藻酸钠凝胶的透气性和保水性，从而提高了人工种子萌发率。同时曾颖苹等[19]研究发现人工种子的萌发率还与其失水率有关。本次试验将部分人工种皮进行了二次包埋，主要是为了降低种子的失水率，并与一次包埋种子形成对照，结果表明二次包埋明显降低了失水率，利于种子萌发。

a.培养皿组变干的人工种子；b.人工种子在培养皿中萌发；c.培养基组污染的人工种子；d.人工种子在培养基中萌发。图2 不同萌发基质对人工种子萌发率的影响

表4 不同萌发基质下人工种子萌发率差异

注:同列数据后不同字母表示差异显著。

本次试验发现在不同萌发基质中，1/2 MS浸润滤纸的培养皿中的人工种子在14 d左右逐渐出现污染情况，种子无失水，20 d时的萌发率达31%；而用无菌水浸润滤纸的培养皿中的人工种子，在12 d左右时种子逐渐失水变干，但并无污染情况，分析其原因可能是培养皿密封不严，加之1/2 MS高营养物浓度导致增加染菌几率，从而降低人工种子萌发率。作为调整，后续培养皿组试验均用封口膜封住培养皿边缘来减少染菌情况，但经后期试验发现，此现象并无减少。加有激素的MS培养基中的人工种子在10 d左右开始萌发，20 d时萌发率达87%，而普通MS培养基中的人工种子萌发较慢，在12 d时逐渐开始萌发，20 d时的萌发率达84%，分析原因是激素对人工种子的萌发起到促进作用，但不明显。通过上述正交试验因素分析也可得出此结论，这与薛建平[20]对半夏人工种子的研究结果一致。

人工胚乳为人工种子的萌发提供营养物质，研究发现在人工胚乳中添加植物激素、碳水化合物、杀菌剂、防腐剂可提高人工种子萌发率[21-22]。本试验得出杀菌剂多菌灵影响人工种子萌发的效果达到显著水平，但在本试验中虽然杀菌剂和防腐剂会起到降低污染率的作用，但仍然存在污染，可能是操作过程不严谨，导致染菌，因此人工种子制作过程要严格无菌才能保证人工种子的质量。

综上分析，人工种子制作及培养过程中，失水和污染是影响种子萌发的最重要两大制约因素，因此人工种子制作过程中人工外膜和胚乳成分的改进还是有待突破的难题，虽然目前已有很多良好的复合型包裹材料，如Elvax4260、半疏水聚合物等[23]。但考虑到有些制膜程序复杂，成本高及胚乳的不保水、机械性能差、易粘连等问题，所以人工种子外膜及胚乳成分这一领域仍有待深入研究。