杨和川，谭一罗，苏文英，秦裕营，马 腾，周振玲

(江苏省连云港市农业科学院，江苏 连云港 222000)

杏鲍菇(Pleurotuseryngii)又名刺芹侧耳，营养丰富，具有抗氧化、抗糖尿病、抗衰老的药理作用，深受消费者喜爱[1-3]。杏鲍菇是当前工厂化栽培的珍稀食用菌之一，具有良好的经济价值。但杏鲍菇生育期、形态特征等往往受环境因素的影响，同一杏鲍菇菌株在不同环境下农艺性状差异较大[4]。同时，由于菌种市场广泛存在同种异名、异种同名的问题，为杏鲍菇菌种管理、育种研究、产业发展带来困难。因此，研究当前生产的杏鲍菇菌株遗传多样性，对杏鲍菇菌种鉴定、遗传育种等具有重要意义。

近年来，分子标记技术广泛应用于食用菌分类鉴定和遗传育种，包括核糖体DNA内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)、相关序列扩增多态性(Sequence-Related Amplified Polymorphism，SRAP)、随机扩增多态性DNA(Randomly Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、简单重复序列区间(Inter-Simple Sequence Repeats，ISSR)等[5-9]。RAPD分子标记技术采用随机寡核苷酸序列作为引物，以基因组DNA作为模板，具有程序简单、不需要基因组分子信息的特点。李红等[10]利用筛选出的8条RAPD分子标记引物对35株金针菇菌株进行遗传多样性分析，将供试金针菇菌株划为五大类群。王锦锋等[11]采用RAPD技术将14株供试香菇菌株在相似系数0.67水平上聚为2类。赵同心等[12]通过拮抗试验、酯酶同工酶、RAPD分子标记以及ITS对3种侧耳品种从形态、蛋白质、分子水平分析进行了亲缘分析。为了减少杏鲍菇在实际生产中品种混乱而引起的栽培风险，研究当前杏鲍菇种质的遗传多样性，本研究对10株杏鲍菇菌株进行了RAPD分子标记分析，以期为杏鲍菇种质资源管理和良种选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

10株供试杏鲍菇菌株编号、名称及特性如表1所示。

表1 供试杏鲍菇菌株编号及来源

1.2 试剂和仪器

试剂：DL2000 DNA Maker、6×Loading buffer、50×TAE缓冲液、GoldView核酸染料均购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司，Dream Taq mix(2×)购于Thermo Fisher Scientific公司(美国)、DNA提取试剂盒购于康为世纪生物科技有限公司，引物由南京金唯智生物科技有限公司合成。其他试剂购于北京奥博星生物技术有限公司。

仪器：PCR仪为德国艾本德股份有限公司产品，电泳仪及电泳槽为伯乐生命医学产品(上海)有限公司产品。

1.3 培养基

MYG固体培养基：葡萄糖5 g、酵母浸出粉5 g、麦芽糖10 g、琼脂粉15 g、水1000 mL，pH值自然，该培养基用于杏鲍菇菌丝培养。

1.4 试验方法

1.4.1 总DNA提取 将供试的10株杏鲍菇菌株分别接种于MYG固体培养基平皿中央，25 ℃培养8 d，刮取平皿上杏鲍菇气生菌丝置于1.5 mL离心管中，放入液氮迅速冷冻并用研磨棒充分研磨，采用DNA提取试剂盒提取杏鲍菇基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA提取效果，提取的DNA于-20 ℃保存备用。

1.4.2 RAPD-PCR扩增 RAPD使用的20条引物序列见表2。PCR反应体系20 μL，其中模板DNA 0.5 μL，引物1 μL，DreamTaq PCR Master Mix(2×)10 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应程序：92 ℃预变性5min，92 ℃变性1 min，35 ℃复性1 min，72 ℃延伸2 min，循环40次，72 ℃延伸10 min，扩增产物于-20 ℃下保藏。从20条RAPD引物中筛选8条谱带清晰、多态性丰富的引物，采用1%琼脂糖凝胶电泳，拍照记录电泳结果。

表2 RAPD扩增使用引物

1.4.3 数据处理 对筛选后引物的电泳图进行条带统计，泳道之间相同位移上的条带记为“1”，相同位移无条带处记为“0”，由此得到0/1矩阵。使用软件NTSYSpc 2.11对矩阵进行分析并计算遗传相似系数，采用非加权配对算数平均法(Unweighted Pair-Group Method With Arithmetic Means，UPGMA)进行聚类分析,基于原始矩阵开展主成分分析(Principal Component Analysis，PCoA)。

2 结果与分析

2.1 杏鲍菇菌株RAPD-PCR分析

从20条RAPD引物中筛选出条带清晰、多态性丰富、重复性良好的引物共8条，分别是S27、S32、S75、S90、S94、S159、S2056、S2111(图1)。使用这8条引物对供试菌株进行多态性分析(图2)，共扩增47个位点，其中多态性位点36个，多态性比率为77%，说明RAPD分子标记多态性较好。

1、2对应供试菌株编号P1、P2；M为DL2000 DNA Marker图1 部分RAPD-PCR的引物筛选

1～10对应供试菌株编号P1～P10；M为DL2000 DNA Marker图2 引物S94、S159、S2056、S2111对10株杏鲍菇菌株的扩增电泳图谱

2.2 供试菌株遗传相似性分析

计算供试杏鲍菇菌株的遗传相似系数(表3)，遗传相似系数越大，说明亲缘关系越近。供试菌株的遗传相似系数在0.556～1.000，菌株P3与菌株P8的遗传相似系数最小，为0.556，说明菌株P3与菌株P8的亲缘关系较远；菌株P2与菌株P5的遗传相似系数最大，为1.000，说明杏鲍菇菌株P2和P5可能是同种异名。

表3 杏鲍菇菌株遗传相似系数

2.3 供试菌株UPGMA聚类分析

采用UPGMA法进行聚类分析，构建供试杏鲍菇菌株遗传亲缘系树状图(图3)。当遗传相似系数为0.62时，10株供试杏鲍菇菌株被聚为1类；遗传相似系数在0.68水平上被聚为3类，类群Ⅰ包含菌株P1、P3、P4、P7、P9、P10，类群Ⅱ包含菌株P2、P5、P6，类群Ⅲ包含菌株P8，说明菌株P8与其他供试菌株亲缘关系较远。

2.4 供试菌株的主成分分析

对10株供试杏鲍菇种质的原始矩阵进行主成分分析，得到二维图(图4A)和三维图(图4B)。第1主坐标和第2主坐标的方差贡献率分别为54.87%和22.48%。由图4A可以看出二维聚类图将供试菌株明显分为3类，图4A和图4B均显示菌株P2、P5、P6的亲缘关系较近，菌株P1、P3、P7、P9的亲缘关系较近；比较图1和图2，主成分分析结果与遗传相似系数0.68水平上的UPGMA聚类分析结果一致。

3 小结与讨论

杏鲍菇子实体农艺性状极易受温度、湿度、光照、二氧化碳浓度等环境影响，仅以子实体性状难以对杏鲍菇菌株做出准确的鉴别。因此，探索一种能够快速进行杏鲍菇菌株鉴定的方法对研究杏鲍菇菌株间亲缘关系尤为重要。其中，RAPD技术不依赖菌株基因组序列信息，流程简单、成本低是一种良好的菌株亲缘关系鉴定方法。

供试杏鲍菇菌株按菌盖颜色可以分为淡黄色、浅棕色、灰褐色，其中P1、P2、P7为浅棕色菌株，P8为灰褐色菌株，其余为淡黄色菌株。利用RAPD技术对10株供试杏鲍菇菌株进行遗传多样性分析，聚类分析结果将灰褐色菌株P8单独聚为一类，但是淡黄色、浅棕色菌株无法按其菌盖颜色进行分类。菌株P2、P5的遗传相似系数为1.00，但是其菌盖颜色明显不同，说明不是同种异名菌株，采用本试验中的8条RAPD引物并未将二者区分，因此在利用RAPD进行菌株亲缘关系研究时，还应当参考菌株农艺性状、拮抗试验结果等，同时，加大RAPD随机引物数量，才能更精确地对菌株亲缘关系进行研究。遗传相似系数矩阵、UPGMA聚类图和主成分分析图综合表明类群Ⅰ、类群Ⅱ、类群Ⅲ能明显划分，说明同类群内亲缘关系较近。由此可知，RAPD分子标记是研究杏鲍菇遗传多样性的有效方法，但是单一分子标记在进行分析时存在偏差，结合多种分子标记进行综合分析，开发特异性高的分子标记对杏鲍菇菌株鉴定、知识产权保护、育种研究有重要意义。

图3 10株杏鲍菇菌株的UPGMA聚类分析

图4 供试菌株主成分分析