陈妙妙，沈 硕，李伟佳

（青海大学，青海大学农林科学院，青海省马铃薯育种重点实验室，青藏高原生物技术教育部重点实验室，青海西宁 810016）

马铃薯干腐病是由茄病镰孢侵染块茎造成的病害，其病原种类有9个种和变种［1］。受侵害的块茎在温度较低、湿度较高的环境下痊愈的速度很慢并且病害部位会进一步扩大［2］。马铃薯在收获期间抗病性虽大，但伤口易受病害的侵染［3］。通常情况下，马铃薯窖藏期间由干腐病造成的马铃薯产量损失为6% ～25%，严重时高达60%［4-5］。由此可见，马铃薯干腐病的防治，尤其是对生物防治的研究具有重要的意义。

近年来，从青稞白酒糟醅中分离到的多株活性菌为芽孢杆菌属，并具有较高的抑草、抑菌及抗病毒活性，具有作为生物防治菌剂及微生物源生物防治制剂开发的潜力［6-7］。目前有关生物防治细菌抑制植物病原菌的报道越来越多，但生防细菌抑制马铃薯干腐病病原菌活性方面的报道很少。本研究选取实验室前期分离自青稞白酒糟醅对马铃薯干腐病病原菌具有较高抑制活性的菌株JZ2-1-12，根据形态学、生理生化特征及分子生物学方法对其进行鉴定，再对其发酵液乙酸乙酯及正丁醇提取物的抑菌活性进行研究，拟为菌株JZ2-1-12抑制马铃薯干腐病病原菌活性物质的分离纯化和结构鉴定奠定基础，从而为微生物来源的马铃薯干腐病生物防治制剂的开发提供新的理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

菌株JZ2-1-12分离自青稞白酒糟醅，由青海大学农林科学院生物技术研究所微生物实验室分离纯化并保存；马铃薯干腐病病原菌青9A-5-2（Fusarium solani）分离自青薯9号病薯块茎，由青海大学农林科学院生物技术研究所微生物实验室分离纯化并保存。

1.2 供试培养基

病原菌的活化及抑菌试验培养基（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉15 g、蒸馏水1 000 mL）。菌株JZ2-1-12发酵培养基（牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、蒸馏水1 000 mL、pH 7.0～7.2）。

1.3 菌株活化

从4℃冰箱中取出保存的菌株JZ2-1-12，划线接种于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，置于培养箱中30℃培养2 d。挑取单菌落，划线接种于新的培养基平板上，放置于培养箱中30℃培养3 d后备用［8］。

1.4 菌株JZ2-1-12的鉴定

1.4.1 菌株JZ2-1-12的形态学鉴定

取经活化的菌株JZ2-1-12，观察菌株生长的菌落形态特征（包括形状、大小、光泽、隆起形状、透明度、边缘等）及菌体形态特征（包括革兰氏染色、芽孢形态及运动性）。

1.4.2 菌株JZ2-1-12的生理生化特征鉴定

科学技术的飞速发展使移动短视频平台更加方便地融入到了大众的生活之中，降低了内容生产的门槛，增加了用户对短视频平台的使用率，使用户可以随时随地分享生活，让更多的消费者有选择的空间。

根据文献［9］对菌株JZ2-1-12进行柠檬酸盐试验、接触酶、葡萄糖氧化发酵、糖、醇类发酵、甲基红 （M.R）、V-P测定、O-硝基苯-β-D吡喃半乳糖苷酶 （ONPG）测定、硝酸盐还原、明胶液化以及石蕊牛奶试验。

1.4.3 菌株JZ2-1-12的分子生物学鉴定

采用上海生物工程股份有限公司的柱式细菌DNA提取试剂盒的程序提取菌株DNA。PCR扩增体系:10 × PCR Buffer 2.5 μL，dNTP （10 mmol/L）2 μL，引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1 492R（5′-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3′）各 1 μL，模板 DNA 1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.5 μL，ddH2O补足至25μL。PCR反应条件为94℃ 5 min；94℃ 10 s、54℃ 30 s、72℃ 80 s、35个循环；72℃10 min。待反应结束，取5μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR产物送至上海生物工程股份有限公司进行测序，将测序结果提交至网站http:∥www.ezbio cloud.net进行16S rDNA序列比对，确定菌株的分类地位。通过MEGA 7.0软件进行菌株序列分析及系统进化树的构建［10］。

1.5 菌株发酵液的制备

将培养好的菌株JZ2-1-12接种于装瓶量为400 mL的液体培养基中，置于恒温摇瓶柜中33℃，180 r/min振荡培养5 d，收获发酵液。发酵液经布氏漏斗减压过滤去除菌体，即获得去菌体发酵液。

1.6 菌株发酵液提取物的制备及抑菌活性测定

取500 mL去菌体发酵液置于3 000 mL的分液漏斗中，依次用等体积乙酸乙酯和正丁醇与其充分接触混匀，分别萃取3次，静置待发酵物和有机相分层，收集并合并有机相。萃取获得的有机相经旋转蒸发仪减压浓缩分别得到乙酸乙酯和正丁醇提取物浸膏。将其用无菌水分别配制成浓度为6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 mg/mL的溶液，经0.22μm微孔滤膜抽滤3次，以无菌水作为对照，每个处理重复3次。采用牛津杯法［11］测定发酵液提取液的抑菌活性。计算公式如下:

参考张志祥等［12］的方法，采用浓度对数-抑菌率概率值法求得毒力回归方程及抑制中浓度（EC50）。

1.6.1 菌株发酵液提取物对马铃薯干腐病病原菌菌丝形态的影响

1.6.2 菌株发酵液提取物对马铃薯干腐病病原菌孢子萌发的影响

采用凹玻片培养法［14］，将菌株JZ2-1-12发酵液乙酸乙酯及正丁醇提取物分别配制成浓度为6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 mg/mL的溶液，吸取30 μL马铃薯干腐病病原菌孢子悬浮液（1×106CFU/mL）于凹玻片的凹槽中，再分别吸取30μL不同浓度的提取物溶液于凹槽中并混匀，以无菌水作为对照。盖上盖玻片将其置于培养皿中，置于28℃培养箱中培养，当对照的孢子萌发数（芽管的长度超过孢子直径的一半）达到70% ～80%时，在显微镜下观察计数［15］。每个处理重复3次，取其平均值。孢子萌发抑制率按照以下公式计算:

1.7 数据分析

运用Microsoft Excel 2010及SPSS19.0进行数据统计，采用Duncan氏新复极差法进行差异显著性（P ＜0.05）检验。

2 结果与分析

2.1 菌株JZ2-1-12的鉴定

2.1.1 菌株JZ2-1-12的形态学鉴定

如图1所示，菌株JZ2-1-12经革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阳性菌，细胞呈直杆状，以周生鞭毛运动。菌落边缘整齐，呈乳白色，不透明，扁平，表面褶皱。

2.1.2 菌株JZ2-1-12的生理生化鉴定

由表1可知，菌株JZ2-1-12可使明胶液化，可利用柠檬酸盐，使蔗糖及甘露醇发酵。石蕊牛奶试验呈凝固状态。有或无氧分子参与均能分解葡萄糖。其中接触酶试验、硝酸盐还原、V-P试验均呈阳性。甲基红和ONPG试验均呈阴性。

表1 菌株JZ2-1-12生理生化鉴定结果Tab.1 Physiological and biochemical identification results of strain JZ2-1-12

2.1.3 菌株JZ2-1-12的分子生物学鉴定

将菌株 JZ2-1-12（MN083310）测序得到的 16S rDNA序列（1 379 bp）提交至 https:∥www.ezbiocloud.net网站，与数据库中已知的16S rDNA序列进行比对，下载与菌株JZ2-1-12的16SrDNA序列同源性大于95%的菌株序列，通过MEGA 7.0软件构建系统发育树（图2）。菌株保藏号为GDMCC No:60696，于2019年6月17日保藏至广东省微生物菌种保藏中心。由图2可知，菌株JZ2-1-12与已知菌株Bacillus subtilis subsp.subtilis（ABQL01000001）聚类于同一分支，亲缘关系最近，相似度高达99.93%。结合菌株JZ2-1-12的形态学、生理生化特征及分子生物学鉴定结果，最终确定菌株JZ2-1-12为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis subsp.subtilis）。

2.2 菌株JZ2-1-12发酵液提取物的抑菌活性

2.2.1 发酵液提取物对马铃薯干腐病病原菌的抑制活性

由表2可知，当乙酸乙酯提取物溶液的浓度为12.50 mg/mL时对马铃薯干腐病病原菌的抑制活性最高，抑制率达到75.00%；当正丁醇提取物溶液的浓度为50.00 mg/mL时对马铃薯干腐病病原菌的抑制活性最高，抑菌率为66.13%。采用SPSS 25.0软件对抑菌活性结果进行差异显著性分析，当乙酸乙酯提取物溶液的浓度为12.50 mg/mL时，其与25.00，50.00、100.00 mg/mL的抑制效果差异不显著（P＞0.05）。正丁醇提取物溶液的浓度为50.00 mg/mL时，与100 mg/mL的抑制效果差异不显著（P＞0.05）。经毒力回归方程可得:乙酸乙酯及正丁醇提取物溶液对马铃薯干腐病病原菌的抑制活性的EC50分别为0.19、12.96 mg/mL，表明菌株发酵液乙酸乙酯提取物溶液对马铃薯干腐病病原菌的抑制效果更强。

2.2.2 发酵液提取物对马铃薯干腐病病原菌菌丝的致畸作用

挑取邻近抑菌带边缘的菌丝（图3b、图3c），以远离抑菌带边缘的菌丝（图3a）作为对照，观察发酵液提取物对马铃薯干腐病病原菌菌丝的致畸作用。正常状态的马铃薯干腐病病原菌菌丝粗细均一、表面光滑、饱满。邻近正丁醇提取物处理的抑菌带边缘的菌丝出现盘曲折叠的情况，同时出现菌丝分叉、断裂及粗细不均的现象。邻近乙酸乙酯提取物处理的抑菌带边缘的菌丝末端膨大，同时也出现了不同程度的缠绕、扭曲、畸形和断裂的现象。

表2 菌株发酵液提取物对马铃薯干腐病病原菌的抑制活性Tab.2 The inhibitory activity of extracts from fermentation broth on potato dry rot

2.2.3 发酵液提取物对马铃薯干腐病病原菌孢子萌发的影响

如表3所示，当乙酸乙酯提取物溶液浓度为12.50 mg/mL时，孢子数最少（仅有7 950个左右），对病原菌孢子的萌发抑制率达到69.64%；当正丁醇提取物溶液浓度为50.00 mg/mL时，对病原菌孢子的萌发抑制率为68.99%；采用SPSS25.0软件对抑菌活性结果进行差异显著性分析，当乙酸乙酯提取物溶液的浓度为12.50 mg/mL时，其与25.00、50.00、100.00 mg/mL的抑制效果差异不显著（P＞0.05）。正丁醇提取物溶液的浓度为50.00 mg/mL时，其与100 mg/mL的抑制效果差异不显著（P＞0.05）。经毒力回归方程可得:乙酸乙酯及正丁醇提取物溶液对马铃薯干腐病病原菌孢子萌发的EC50分别为0.93和9.36 mg/mL，试验表明发酵液提取物能有效地抑制马铃薯干腐病病原菌孢子的萌发。

表3 菌株发酵液提取物溶液对马铃薯干腐病病原菌孢子萌发的影响Tab.3 Effect of extract solution of fermentation broth on spore germination of potato dry rot pathogen

3 讨论与结论

本试验对分离自青稞白酒糟醅的菌株JZ2-1-12进行形态学、生理生化特征和分子生物学鉴定，确定菌株JZ2-1-12为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis subsp.subtilis）。抑菌活性研究结果发现:乙酸乙酯及正丁醇提取物溶液对马铃薯干腐病病原菌的EC50分别为0.19、12.96 mg/mL，菌株JZ2-1-12发酵液乙酸乙酯提取物溶液对马铃薯干腐病病原菌的抑制效果更强。经提取物处理的抑菌带边缘的菌丝出现盘曲折叠的情况，同时菌丝出现畸形、分叉、断裂及粗细不均的现象。将未经发酵液提取物处理的马铃薯干腐病病原菌孢子培养至20 h时，对马铃薯干腐病病原菌孢子萌发的EC50分别为0.93、9.36 mg/mL，这说明菌株JZ2-1-12发酵液乙酸乙酯提取物溶液对马铃薯干腐病病原菌孢子萌发具有较高的抑制作用。

本次研究表明:枯草芽孢杆菌次级代谢产物具有较好的抑菌活性及较广的抑菌谱［16-17］。在非核糖体途径中合成的脂肽类物质（如伊枯草素、表面活性素和丰原素）可抑制植物病原菌正常生长且导致病原菌菌丝体畸形［18-19］。另外，枯草芽孢杆菌S3对刺盘孢属、链格孢属、镰孢属病菌都有明显的抑菌效果，尤其对镰孢属病菌的抑菌效果最好，平均抑菌率达50%以上［20］。已有研究人员对枯草芽孢杆菌在抑制植物病原菌活性方面开展了广泛的研究［18-20］，但对枯草芽孢杆菌抑制植物病原菌的靶标位点及活性化合物的结构尚不明确。因此，后续研究的关键在于对菌株发酵液提取物中的活性物质进行分离，纯化及结构鉴定，并使其产品化以实现对马铃薯干腐病的生物防治。同时，将废弃的青稞白酒糟醅开发成一种新型微生物能源，并从中分离到有效抑制马铃薯干腐病的活性菌株，并将其开发成生物制剂，将对马铃薯干腐病病害的防治以及生态环境的保护具有重要的意义。