王迪 黄小凤 莫丽军 蒋惟 向晓华 韦传东

【摘要】 目的 研究乳脂球表皮生长因子8（milk fat globule epidermal growth factor Ⅷ，MFG-E8）基因单核苷酸多态性在中国桂北地区汉族人群中的分布频率及其在不同种族间分布的差异。

方法 采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术（PCR-RFLP）和DNA直接测序的方法检测183例中国桂北地区汉族人群MFG-E8基因rs1878326C>A的位点，并结合人类基因组计划（Hapmap）公布的五类人群（非洲人、美籍人、欧洲人、东亚人和南亚人）的SNP分型数据，比较分析这五类人群的基因型及等位基因的分布频率。

结果 中国桂北地区汉族人群中MFG-E8基因rs1878326C>A位点存在多态性，其基因型在男女性别间比较差异无统计学意义（P>0.05）;等位基因频率在男女性别间比较差异无统计学意义（P>0.05）。rs1878326C>A位点的基因型与非洲人和美籍人比较差异有统计学意义（P<0.01）;等位基因分布频率差异有统计学意义（P<0.05或0.01）;而与欧洲人、东亚人及南亚人比较差异无统计学意义（P>0.05）。

结论 中国桂北地区汉族人群中MFG-E8基因存在多态性，与非洲人和美籍人比较差异有统计学意义。这种差异可能为其在不同疾病的研究提供前瞻性基础资料。

【关键词】 乳脂球表皮生长因子8; 单核苷酸多态性;基因型;基因频率

中图分类号：R446.6 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.02.004

【Abstract】 Objective To study the distribution frequency of single nucleotide polymorphism of milk fat globule epidermal growth factor Ⅷ （MFG-E8） gene in Han population of Northern Guangxi and the difference of its distribution in different races.

Methods Restriction fragment length polymorphism polymerase chain reaction（PCR-RFLP） and direct DNA sequencing were used to detect the locus of MFG-E8 gene rs1878326C>A in 183 cases of Han population in North Guangxi，China.The genotypes and allele distribution frequency of five populations（African，American，European，East Asian，and South Asian） published by Human Genome Project（Hapmap） were compared and analyzed via SNP typing data.

Results Polymorphism was found in the rs1878326C>A locus of MFG-E8 gene in Han population in northern Guangxi，whereas no statistical significance existed in the genotype and allele frequency between genders （P>0.05）.Statistical significance was also found in the genotype of rs1878326C>A locus between Chinese and Africans and Americans; the frequency of allele distribution was statistically significant （P<0.05 or 0.01）;there was no significant difference between Chinese populations and those of Europeans，East Asians and South Asians （P>0.05）.

Conclusion Significant difference was observed in the polymorphism of MFG-E8 gene between Han population in northern Guangxi China and that in Africans and Americans，which may provide prospective basic data for its research in different diseases.

【Key words】 milk fat globule epidermal growth factor 8;single nucleotide polymorphism;genotype;gene frequency

乳脂球表皮生長因子8（milk fat globule epidermal growth factor Ⅷ，MFG-E8）是一种亲脂性糖蛋白，分布在乳汁中的脂肪小球外表面。MFG-E8具有介导精-卵结合、增强吞噬清除凋亡细胞黏附、肠上皮细胞的维持与修复、促进树突状细胞的外泌体功能、促进乳腺分支形态发生、促进附睾上皮细胞的维持和促进血管形成等功能。MFG-E8基因位于人类15号染色体长臂2区5带上（15q25），存在单核苷酸多态性。据报道显示，MFG-E8基因多态性与法国人群老年性黄斑病变存在相关性，却与德国人群老年性黄斑病变没有相关性[1]。台湾Hu等[2]报道MFG-E8基因多态性位点rs1878326与系统性红斑狼疮存在相关性，中国内地学者报道指出MFG-E8基因多态性位点rs1878326 A等位基因能减少系统性红斑狼疮的发生风险[3]。因此，分析统计MFG-E8基因rs1878326C>A位点基因型及等位基因频率在不同种族间的分布特点可为进一步研究MFG-E8基因与多种疾病的关联性提供理论数据及分子遗传学基础。

1 对象与方法

1.1 实验对象

随机选取2017年10月～2018年5月在桂林医学院第一附属医院体检的健康汉族人群183例，他们分别来自桂林市、贺州市、柳州市等地。其中男性110例，女性73例。年龄40～87岁，平均（57.32±9.39）岁，实验对象均无冠心病及血缘关系且各项实验室检查指标（肝、肾功能;血脂）均正常。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取

采用亚能生物全血DNA提取试剂按说明书操作步骤进行提取。

1.2.2 引物设计与合成

根据NCBIGenBank基因库中人类MFG-E8基因（MFG-E8：NC_000015.10）rs1878326C>A位点多态性和DNA序列设计PCR引物，交由华大基因公司合成。用于特异性扩增目的基因包含rs1878326C>A位点碱基DNA片段的引物其上游序列为5-ATTGTCCCTTTGTGGTCTTTGT-3，下游序列为：5-CGAGCCTTCTCTCCATTGC-3。

1.2.3 PCR扩增体系

PCR扩增体积为20 μL，其中10 μL 2×PCR Mix[2×Tag PCR Master Mix TIANGEN货号：KT17120]，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，7 μL ddH2O。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，32个循环;72℃平衡10 min [Bio-rad基因扩增仪s1000PCR扩增仪]。

1.2.4 限制性内切酶

NlaⅢ [Thermo Fisher Scientific公司货号：ER1831]。酶切反应体系包括：PCR产物10 μL、10 X BufferG 2 μL、NlaⅢ 1 μL、双蒸水18 μL。37℃酶切消化16小时，限制性内切酶切割后的DNA片段用2%琼脂糖凝胶进行电泳，在凝胶成像系统中结合DNA标准分子量来对各种基因型进行判断并记录酶切结果。

1.2.5 PCR产物直接测序

每个SNP位点随机抽取4个交由华大基因公司进行测序以验证限制性内切酶酶切反应判断的基因型是否正确。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件包进行统计学分析。基因型和等位基因频率采用基因直接计数法计算，等位基因及基因型分布进行遗传平衡检验（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE），各组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验，檢验水准：α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 中国桂北地区汉族人MFG-E8基因型检测结果

SNP分型结果显示，rs1878326位点存在CC、CA和AA 3种基因型。MFG-E8基因rs1878326C>A多态性位点的PCR产物片段大小和酶切产物大小见表1。琼脂糖凝胶电泳条带见图1。DNA测序结果见图2。

2.2 中国桂北地区汉族人MFG-E8基因多态性分布

MFG-E8基因rs1878326C>A位点的基因型及等位基因频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡，说明所选的研究样本具有群体代表性。其中rs1878326C>A位点基因型以CA型多见，其等位基因以C型频率最高，占56.0%。中国桂北地区汉族人MFG-E8基因rs1878326C>A位点存在多态性，而这种多态性的基因型频率及等位基因频率在男女性别间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3 MFG-E8 基因多态性在不同种族人群中的分布比较

中国桂北地区汉族人MFG-E8基因rs1878326C>A多态性分布频率与人类基因组计划 （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）公布的五类人群（非洲人、美籍人、欧洲人、东亚人和南亚人）的SNP分型数据进行比较，结果显示，中国桂北地区汉族人MFG-E8基因rs1878326C>A多态性基因型和等位基因的分布频率与非洲人和美籍人比较差异有统计学意义（P<0.05或0.01），而与欧洲人、东亚人和南亚人比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表3。

3 讨论

乳脂球表皮生长因子8是由巨噬细胞和树突状细胞合成分泌的磷脂酰丝氨酸与整联蛋白结合的糖蛋白，其在哺乳动物上皮细胞、附睾上皮、血管平滑肌、肠黏膜的巨噬细胞中均有表达[4～6]。在人类中表达的MFG-E8长约53 kDa，在蛋白质的成熟中发挥着重要的作用。MFG-E8的N-端是由两个类表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）所构成的重复序列，有1个精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（RGD）序列位于第2个EGF上，RGD能够与位于细胞表面的整联蛋白二聚体结合，介导整合素受体αvβ3、αvβ5相关信号传导，促进细胞之间的黏附、增殖、分化及凋亡[7～8]。编码MFG-E8的基因定位于人类的15号染色体长臂上。MFG-E8在许多疾病的病理生理过程中起作用。据报道在胃肠缺血-再灌注损伤小鼠模型中起到保护肠道的屏障作用[9]。诱导缺乏MFG-E8的小鼠形成动脉粥样硬化，可发现小鼠凋亡细胞的吞噬作用显著降低，发生动脉粥样硬化的病变部位显著扩大[10]。在Alzheimers病的发生发展中，当MFG-E8表达不足或水平较低，凋亡细胞不能被及时清除，诱发了Alzheimers的产生以及加速其恶化[11]。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是由于单个核苷酸的改变所引起的DNA序列多态性。MFG-E8基因存在SNP，并且某些位点的单核苷酸多态性与一些疾病存在相关性。在MFG-E8基因rs1878326 A>C位点中rs1878326 A等位基因和CA基因型能降低中国人群患系统红斑狼疮的风险。也有报道显示rs1878326 C等位基因增加法国老年性黄斑变性的风险。因此分析MFG-E8基因多态性在不同种群中的分布特点可以为研究其与疾病的相关性提供遗传学基础。

本研究应用限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术（PCR-RFLP）和DNA直接测序的方法检测了中国桂北地区汉族人群MFG-E8基因rs1878326C>A位点多态性分布情况，结果显示，rs1878326C>A位点表现出CC、CA、AA三种基因型，其所占频率分别为31.7%、48.6%、19.7%。等位基因C和A所占频率为56.0%和44.0%。将中国桂北地区汉族人与非洲人、美籍人、欧洲人、东亚人和南亚人的基因多态性研究结果比较发现，中国桂北地区汉族人MFG-E8基因rs1878326C>A位点CC基因型频率和C等位基因频率显著低于非洲人（64.2%、80.1%）而高于美籍人（14.4%、38.0%）。中国桂北地区汉族人MFG-E8基因rs1878326C>A位点AA基因型频率和A等位基因频率显著高于非洲人（3.9%、19.9%）而显著低于美籍人（38.4%、62.0%），差异有统计学意义;而与欧洲人、东亚人和南亚人比较差异无统计学意义。

综上所述，MFG-E8基因rs1878326C>A位点基因型分布及等位基因频率在不同种族间有着显著差异，这为以后研究与MFG-E8基因相关疾病在不同种族和区域之间的差异奠定了遗传学基础且提供了分子遗传学数据。

参 考 文 献

[1]Raoul W，Poupel L，Tregouet DA，et al.MFGE8 does not influence chorio-retinal homeostasis or choroidal neovascularization in vivo[J].PloS one，2012（3）：e33244.

[2]Hu CY，Wu CS，Tsai HF，et al.Genetic polymorphism in milk fat globule-EGF factor 8 （MFG-E8） is associated with systemic lupus erythematosus in human[J].Lupus，2009，18（8）：676-81.

[3]陈杰，饶亚华，朱建华.汉族人中MFG-E8基因的多态性与系统性红斑狼疮的关系[J].免疫学杂志，2015，31（11）：1009-1012.

[4]Nakashima Y，Miyagi-Shiohira C，Noguchi H，et al.The Healing Effect of Human Milk Fat Globule-EGF Factor 8 Protein （MFG-E8） in A Rat Model of Parkinsons Disease[J].Brain sciences，2018，8（9）：167.

[5]Gao YY，Zhang ZH，Zhuang Z，et al.Recombinant milk fat globule-EGF factor-8 reduces apoptosis via integrin beta3/FAK/PI3K/AKT signaling pathway in rats after traumatic brain injury[J].Cell death & disease，2018，9（9）：845.

[6]Bu HF，Zuo XL，Wang X，et al.Milk fat globule-EGF factor 8/lactadherin plays a crucial role in maintenance and repair of murine intestinal epithelium[J].The Journal of clinical investigation，2007，117（12）：3673-3683.

[7]Li H，Xu W，Ma Y，et al.Milk fat globule membrane protein promotes C2C12 cell proliferation through the PI3K/Akt signaling pathway[J].International journal of biological macromolecules，2018，114：1305-1314.

[8]Schmitz CR，Oehninger S，Genro VK，et al.Alterations in expression of endometrial milk fat globule-EGF factor 8 （MFG-E8） and leukemia inhibitory factor （LIF） in patients with infertility and endometriosis[J].JBRA assisted reproduction，2017，21（4）：313-320.

[9]Wu R，Dong W，Wang Z，et al.Enhancing apoptotic cell clearance mitigates bacterial translocation and promotes tissue repair after gut ischemia-reperfusion injury[J].International journal of molecular medicine，2012，30（3）：593-598.

[10]Ait-Oufella H，Kinugawa K，Zoll J，et al.Lactadherin deficiency leads to apoptotic cell accumulation and accelerated atherosclerosis in mice[J].Circulation，2007，115（16）：2168-2177.

[11]張莉，刘彧，黄毅，等.乳脂肪球表皮生长因子Ⅷ在血管衰老和血管疾病重塑中的作用[J].中华心血管病杂志，2017，45（3）：261-264.

（收稿日期：2019-10-15 修回日期：2019-12-09）

（编辑：梁明佩）