郭清 张贵森 张宝东

视网膜中央静脉阻塞(central retinal vein occlusion，CRVO)是较为常见的第二大视网膜血管病变疾病，其主要特征表现为视网膜水肿、出血，视网膜血液瘀滞、静脉迂曲扩张[1]。CRVO发病机制较为复杂，为多因素致病，常与其他眼部疾病、心血管疾病相关。CRVO往往导致黄斑水肿，进而引起患者中心视力下降，严重影响患者生活[2]。因此CRVO伴发黄斑水肿也受到医学界的重视。有研究表明，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在疾病的发展过程中具有重要作用[3]。研究发现，VEGF促进患者眼部血管新生，血管渗透，目前常使用抗VEGF药物治疗CRVO伴发黄斑水肿[4]。随着对疾病的研究深入到基因层面，发现miR-146a在糖尿病视网膜病变中具有重要作用[5]。但miR-146a在CRVO伴发黄斑水肿中的研究笔者所见鲜有报道，故本研究探讨CRVO伴发黄斑水肿患者房水中miR-146a与VEGF的表达，并分析其相关性和表达意义，为临床诊治提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年2月至2018年8月在我院就诊的112例CRVO伴发黄斑水肿患者(研究组)，男52例，女60例；年龄30～65岁，平均年龄(51.18±5.37)岁；病程1周～13个月。另选取同期60例无眼部疾病的白内障患者为对照组，男26例，女34例；年龄30～67岁，平均年龄(50.37±5.61)岁。2组性别比、年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①经过相干光断层成像(OCT)、荧光素眼底血管造影(FFA)检查明确诊断为CRVO伴发黄斑水肿患者；②既往未使用抗VEGF药物治疗；③无其他眼部手术史；④经医院伦理委员会批准，患者及家属自愿参与本研究并签署知情同意书。

1.2.2 排除标准：①具有高眼压患者；②眼部活动性炎症患者；③妊娠期和哺乳期患者；④患有全身其他系统性疾病，影响房水中细胞因子的表达。

1.3 方法

1.3.1 一般检查:患者入院后接受全面的眼科检查。患者经FFA、OCT(德国，Carl-Zeiss Medite公司)、眼底彩照进行确诊，另外进行验光、眼内压(IOP)、最佳矫正视力、眼部B超、裂隙灯检查，所有研究对象进行包括血常规、血压、血糖、心率等的基本检查，评价患者是否耐受玻璃体腔用药。

1.3.2 房水采集:患者按照内眼手术规范进行消毒，用盐酸奥布卡因滴眼液麻醉患眼，采用1 ml 注射器针头于角膜穿刺入前房缓慢抽取房水0.1～0.5 ml，撤针后角膜穿刺口自闭。收集房水于不含热源和内毒素的离心管中，15 000 r/min 离心10 min，避光保存于-70℃冰箱中。收集房水后使用开睑器开睑，结膜囊内消毒，于颞上方角膜缘处3.5～4.0 mm进行玻璃体腔注药(雷珠单抗0.05 ml/0.5 mg)，注射结束后结膜囊内涂抗生素眼膏。

1.3.3 qRT-PCR检测miR-146a与VEGF表达水平:取冻存的房水标本按照Trizol试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)说明书提取总RNA，紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度，将RNA反转录为cDNA并以相对应的cDNA为模板对miR-146a、VEGF进行qRT-PCR检测。反应体系为25 μl：SYBR Green Ⅰ qPCR Master Mix 12 μl，上下游引物各1 μl，cDNA模板1 μl，ddH2O 10 μl。反应程序为：95℃ 10 min；95℃ 15 s；48℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环。引物均由上海生工公司合成。反应结束后收集数据进行Ct值分析，以GADPH为内参基因，采用2-ΔΔCt算法计算miR-146a、VEGF的相对表达量。见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 TNF-α、IL-6、VEGF水平检测:采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者房水中TNF-α、IL-6、VEGF水平，试剂盒均购自上海酶联生物，操作步骤严格按照试剂盒操作说明进行。

2 结果

2.1 2组患者临床资料比较 2组患者年龄、性别比、高血压比例差异均无统计学意义(P>0.05)；ELISA检测发现，研究组TNF-α、IL-6、VEGF水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.2 2组患者房水中miR-146a、VEGF mRNA的表达水平比较 qRT-PCR检测房水中miR-146a、VEGF mRNA的表达水平，结果显示研究组中miR-146a(1.03±0.21)表达水平显著低于对照组中miR-146a(7.93±1.51)水平，研究组中VEGF mRNA(3.45±1.02)表达水平显著高于对照组VEGF mRNA(1.02±0.23)水平，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 2组患者临床资料比较

组别miR-146aVEGF mRNA研究组(n=112)1.03±0.21∗3.45±1.02∗对照组(n=30)7.93±1.511.02±0.23

注：与对照组比较，*P<0.05

2.3 患者房水中miR-146a与VEGF的相关性 对患者房水中miR-146a与VEGF进行Pearson相关性分析，显示miR-146a与VEGF呈显著负相关(r=-0.659，P=0.001)，VEGF随miR-146a水平的降低而升高。见图2。

2.4 影响CRVO伴发黄斑水肿的多因素分析 将CRVO伴发黄斑水肿病情为因变量，以年龄、TNF-α、IL-6、miR-146a与VEGF为自变量并进行Logistic多因素回归分析，结果显示TNF-α、IL-6与VEGF水平均是影响CRVO伴发黄斑水肿病情的危险因素，miR-146a是CRVO伴发黄斑水肿病情的保护因素，该病情与年龄无关。见表4。

图2 miR-146a与VEGF相关性分析

表4 影响CRVO伴发黄斑水肿病情的多因素分析

3 讨论

视网膜静脉阻塞是常见的眼底血管疾病，根据阻塞部位不同可分为中央静脉阻塞和分支静脉阻塞。CRVO的病因与视网膜炎症、高血压、血流动力学、动脉硬化疾病等具有密切联系[6]。目前对于CRVO伴发黄斑水肿的治疗主要是玻璃体腔注射雷珠单抗、曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA)、抗VEGF的药物等，但是TA虽然短期内效果良好，但是随着体内药物浓度的减少，水肿会继续出现，需要再次治疗。部分药物对疾病的治疗不彻底，且容易引起患者眼压升高，眼内炎症等不良反应，抗VEGF的药物的效果却更加良好，所以VEGF在CRVO伴发黄斑水肿中的表达和意义有待进一步研究。有研究发现miRNA与多种疾病的发展具有密切联系[3-6]，研究报道，miR-146a可调控机体的炎性反应和细胞重构[7]。目前关于VEGF、miR-146a在CRVO伴发黄斑水肿中的报道笔者所见较少，本研究探讨VEGF、miR-146a在CRVO伴发黄斑水肿中的表达意义及关系，为治疗CRVO伴发黄斑水肿靶点治疗提供理论基础。

VEGF广泛存在于机体多种组织中，在眼部处于正常无疾病状态时视网膜内皮细胞、视网膜色素上皮细胞及周细胞中均表达较低，其在眼部的低表达维持眼部正常[8]。缺氧状态时视网膜细胞产生大量的VEGF，VEGF引起肌动蛋白纤维重构及通透性增加[9]。VEGF过表达引起血管的通透性增加、促进新生血管的形成造成眼内压升高，导致视网膜出血、渗出、水肿，造成黄斑水肿[10]。有研究报道，CRVO患者房水、玻璃体腔中VEGF表达水平上调，其可能破坏了血-视网膜屏障[11]。IL-6可通过改变内皮细胞形态而引发内皮细胞通透性增加[12]。巨噬细胞和肥大细胞等炎性细胞在机体缺血、缺氧状态下可刺激白细胞、血管内皮细胞释放IL-6[13,14]。本研究通过qRT-PCR检测房水中VEGF mRNA的表达水平，结果显示研究组VEGF mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05)，说明VEGF在CRVO伴发黄斑水肿患者中高表达，其促进血管生成，引起黄斑水肿。本研究对房水中IL-6、VEGF水平进行ELISA检测，检测结果显示IL-6水平显著高于对照组(P<0.05)，表明IL-6可能在CRVO伴发黄斑水肿中发挥重要作用，且ELISA检测发现VEGF蛋白水平与检测 mRNA水平相一致，均显著高于对照组。Logistic多因素分析显示，VEGF、IL-6均是影响CRVO伴发黄斑水肿的危险因素，表明VEGF、IL-6均在疾病的发生发展过程中具有促进意义。

miRNA种类繁多，且多种mi RNA在机体的生理、病理过程中发挥重要作用。miR-146a与肿瘤、人体的衰老具有密切联系，研究表明miR-146a可以下调癌细胞中的VEGF的表达[15,16]。研究表明miR-146a在老年性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)中表达较低，其受到TNF-α的诱导负调控IL-6的表达[17]。APRE-19细胞中过表达miR-146a可以抑制VEGF的表达，表明在AMD中miR-146a可能通过抑制VEGF的表达发挥其生物功能[18]。TNF-α可提高血管内皮生长因子、VEGF等的反应性[19]。TNF-α由活化的单核细胞和巨噬细胞产生，其刺激多种黏附因子、炎性因子的产生，引起血管及组织损伤[20]。本研究通过qRT-PCR检测房水中miR-146a的表达水平，结果显示研究组miR-146a mRNA表达水平显著低于对照组(P<0.05)，Pearson相关性分析显示miR-146a与VEGF呈显著负相关(r=-0.659,P=0.001)，说明miR-146a在CRVO伴发黄斑水肿患者中低表达，可能miR-146a对VEGF的抑制作用减弱，造成VEGF表达水平升高，造成黄斑水肿。本研究对房水中TNF-α水平进行检测，结果显示TNF-α水平显著高于对照组(P<0.05)，表明TNF-α可能在CRVO伴发黄斑水肿中发挥重要作用，其可能是刺激炎性因子的产生促进眼部炎性反应、促进VEGF的产生，引起血管增多。Logistic多因素分析显示，TNF-α是影响CRVO伴发黄斑水肿的危险因素，miR-146a是疾病发展的保护因素，表明miR-146a可能对疾病具有抑制作用，可为疾病的治疗提供靶点。

综上所述，CRVO伴发黄斑水肿中miR-146a、VEGF表达水平相关，疾病发生、发展过程中可能是miR-146a对VEGF的抑制作用减弱，可为提高CRVO伴发黄斑水肿的诊疗效果提供新的研究思路。