张贤莉 占义霞

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率在女性恶性肿瘤中居世界第二位，死亡率在女性恶性肿瘤中居世界第一位[1,2]。统计显示2008年全球宫颈癌新发病例为53万左右，2012年全球宫颈癌死亡人数为27万左右[3]。实体瘤的主要治疗手段为手术切除，宫颈癌的手术治疗主要用于宫颈癌早期患者，同时加以放化疗辅助治疗，而对于晚期侵袭转移和复发患者的治疗效果不佳[4]，目前缺乏有效的治疗方法，使得宫颈癌患者5年生存率仅有40%左右[5]，而宫颈癌的发病分子机制尚未完全阐明，在分子水平研究宫颈癌发病的关键分子，可能对治疗宫颈癌提供新的方法。长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类长度超过200个核苷酸的非编码转录本，在肿瘤发生发展的各个方面发挥关键作用[6,7]。有报道LINC01133在肺癌、胃癌、肝癌等常见肿瘤中发挥异常[8-10]，且调控重要的生物学功能，可能是肿瘤发生发展中的重要因子，Mao等[11]报道 LINC01133是预测宫颈鳞癌患者存活率低的15个高表达lncRNAs之一，在宫颈癌中的其他研究尚未见报道。本文研究LINC01133在宫颈癌组织中的表达水平及与患者临床特征的关系，同时以宫颈癌细胞株HeLa为研究对象研究LINC01133在宫颈癌细胞中具体的生物学功能及作用机制，旨在为宫颈癌分子靶向药物的发掘提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012年12月至2017年12月入住我院行手术治疗的宫颈癌患者标本，要求患者未合并其他肿瘤或具有生命威胁的疾病，术前未进行放化疗、靶向治疗等抗肿瘤治疗，并且具有完整的病例和随访资料，由病理专家证实为宫颈癌，共获得宫颈癌手术切除标本60例，另选取40例由于良性病变等原因获得的正常宫颈组织为对照。患者签署知情同意书，并由医院伦理委员会审核通过。

1.2 试剂与仪器 宫颈癌细胞系HeLa、caski、siha和人宫颈上皮永生化细胞H8购自美国ATCC细胞库；DMEM高糖、RPIM-1640、DMEM-F12培养基及FBS均购自美国Gibco公司；反转录、qRT-PCR试剂盒等购自日本TaKaRa公司；LINC01133 siRNA由上海吉凯有限公司设计合成；蛋白裂解液购自美国Thermo公司；MTS增殖试剂盒购自美国biovision公司；Transwell小室购自美国corning公司； pPI3K抗体(ab125633)、pAKT抗体(ab38449)、GAPDH抗体(ab181602)购自美国Abcam公司。

1.3 qRT-PCR 收集经液氮冻存研磨的组织及细胞，采用TRIzol裂解法提取总RNA。设计合成LINC01133引物F:5’-GCTGTGGTGGAGAGAATGGA-3’,R:5’-CCCCAGCTTTCCAGATCCA AA-3’。内参GAPDH引物F:5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’,R:5’-GCCCA ATACGACCAAATCC-3’。将提取的总RNA逆转录为cDNA，以cDNA作为模板并进行qRT-PCR获得各样品的循环阈值(threshold cvcle，Ct)，采用2-ΔΔCt法分析各组实验数据，检测LINC01133的表达。

1.4 细胞培养及转染 HeLa细胞用DMEM高糖+10%FBS培养，Caski、H8细胞用DMEM-F12+10%FBS培养，siha细胞用RPIM-1640+10%FBS培养，放置在37℃、5%的CO2培养箱中。将呈对数生长期的HeLa细胞胰酶消化后铺至6孔板中，细胞贴壁18～24 h用脂质体2000按说明书将LINC01133 siRNA和对照组NC转染试剂转染至细胞中，分为LINC01133 siRNA组(si-LINC01133)和对照组(si-NC)，培养箱中培养进行后续实验。

1.5 MTS增殖实验 收集转染48 h后的si-LINC01133和si-NC细胞，每组以每孔150 μl培养基、2 000个细胞接种于96孔板中，每组铺0、1、2、3、4和5 d 的细胞量，每天6个复孔，在铺板后相应的时间以每孔加入30 μl MTS工作液培养箱孵育2 h，全波长扫描仪在490 nm波长处测取每孔OD值，OD值越高代表细胞的增殖能力越强。

1.6 Transwell小室实验 收集转染48 h后的si-LINC01133和si-NC细胞，无血清培养基洗3次后以每孔100 μl无血清培养基、1×105个细胞接种于Transwell小室的上室，500 μl含10%FBS培养基加入下室作为趋化因子，培养箱中培养至显微镜下观察穿过掉入下室10个细胞时，取出上室膜PBS洗3次后甲醇固定15 min，苏木素染色。显微镜下随机计数5个视野穿过的细胞，取均值代表细胞转移能力，穿过细胞的个数越多，细胞的转移能力越强。

1.7 划痕实验 收集转染48 h后的si-LINC01133和si-NC细胞，每孔2 ml培养基、2×105个细胞接种于6孔板中置于培养箱，待细胞完全贴壁后，10 μl枪头沿直尺方向划2条划痕，PBS冲洗3次后，加入无血清培养基培养。显微镜下拍照，每24小时记录1次细胞迁移的情况。

1.8 Western-blot检测蛋白表达 收集转染48 h后的si-LINC01133和si-NC细胞，加入蛋白裂解液超声裂解30 min后，4℃ 14 000 r/min离心20 min，上清液移至新的EP管中，BCA检测蛋白浓度，变性后行SDS-PAGE电泳，湿转，8%脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST洗涤3次后加入目的基因一抗稀释液4℃孵育过夜，TBST洗涤3次后，二抗室温孵育2 h，ELC化学发光法曝光条带。

2 结果

2.1 qRT-PCR检测LINC01133在宫颈癌组织中的表达 qRT-PCR检测LINC01133在60例宫颈癌组织和40例正常宫颈组织中的表达情况。LINC01133在宫颈癌组织中的表达(1.21±0.43)显著高于正常宫颈组织(0.84±0.34),差异有统计学意义(t=5.411,P=0.0000)，LINC01133在肿瘤直径≥4 cm组织中的表达显著高于<4 cm组织中的表达，LINC01133在TNM分期Ⅲ～Ⅳ组织中的表达显著高于Ⅰ～Ⅱ组织中的表达，LINC01133在有淋巴结转移的组织中表达水平显著高于无淋巴结转移的组织(P<0.05)。见表1。

项目LINC01133表达量t值P值年龄(岁) <50(n=31)1.04±0.100.0210.902 ≥50(n=29)1.12±0.13肿瘤大小(cm) <4(n=36)1.14±0.363.4660.001 ≥4(n=24)1.50±0.45组织学分级 高分化(n=27)1.18±0.230.8120.354 低分化(n=33)1.23±0.43TNM分期 Ⅰ～Ⅱ(n=43)1.16±0.323.8530.000 Ⅲ～Ⅳ(n=17)1.59±0.53淋巴结转移 无(n=39)1.16±0.323.4160.001 有(n=31)1.53±0.52

2.2 宫颈癌组织中LINC01133的表达对患者预后的影响 对宫颈癌患者术后随访，并按LINC01133在宫颈癌癌组织中的表达水平分为LINC01133高表达组和LINC01133低表达组。Kaplan-Meier绘制患者生存曲线，LINC01133高表达组宫颈癌患者的5年总生存率明显短于LINC01133低表达组(χ2=12.95，P=0.000)。见图1。

图1 宫颈癌组织中LINC01133表达水平与患者术后生存时间的关系

2.3 qRT-PCR检测LINC01133在宫颈癌细胞系中的表达 qRT-PCR结果显示LINC01133在宫颈癌细胞系HeLa、caski和siha中的表达显著高于人宫颈上皮永生化细胞H8，在HeLa中的表达最高(P<0.05)。选择LINC01133表达最高的HeLa细胞系进行LINC01133 siRNA的转染，qRT-PCR检测显示si-LINC01133组中LINC01133的表达为(0.20±0.08)显著低于si-NC组的(1.01±0.06)。见表2。

细胞系LINC01133表达量t值P值HeLa10.14±1.5510.190.000caski5.98±2.233.870.018siha6.17±1.058.520.001H81.00±0.05

2.4 MTS检测沉默LINC01133表达对HeLa增殖的影响 采用MTS法测定si-LINC01133和NC组细胞的增殖能力，与NC组相比，si-LINC01133组细胞增殖能力明显减慢(P<0.05)。见表3，图2。

组别01 d2 d3 d4 d5 dNC组 0.31±0.010.49±0.030.77±0.071.00±0.111.44±0.101.59±0.12si-LINC01133组0.31±0.020.37±0.030.49±0.130.55±0.050.66±0.110.82±0.10P值0.1540.0810.0270.0140.0000.006

图2 MTS检测LINC01133对HeLa细胞增殖能力的影响，与si-NC组比较,*P<0.05

2.5 Transwell小室检测沉默LINC01133表达对HeLa转移能力的影响 采用Transwell小室测定si-LINC01133和NC组细胞的转移能力，si-LINC01133和NC组细胞穿膜数分别为(89.37±9.68)个、(48.14±11.97)个。si-LINC01133组细胞转移能力明显低于si-NC组(P<0.05)。见图3。

图3 Transwell检测LINC01133对HeLa细胞转移能力的影响(苏木素染色×100)

2.6 划痕实验检测沉默LINC01133表达对HeLa划痕愈合能力的影响 采用划痕实验测定si-LINC01133和NC组细胞的迁移能力，si-LINC01133和NC组划痕愈合比分别为(10.34±0.49)%、(30.98±0.57)%。si-LINC01133组细胞迁移能力明显低于si-NC组(P<0.05)。见图4。

图4 划痕实验检测LINC01133对HeLa细胞迁移能力的影响

2.7 沉默LINC01133表达对PI3K/AKT信号通路的影响 采用Western-blot检测各组Hela细胞中pPI3K和pAKT蛋白表达的影响，与si-NC组比较，si-LINC01133组OCT4、pPI3K和pAKT蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图5。

图5 Western-blot检测LINC01133对PI3K/AKT信号通路的影响

3 讨论

宫颈癌作为女性最常见的恶性肿瘤之一，具有高发病率和死亡率，严重威胁女性的生命健康，已经成为重要的公共卫生问题[1,2]。宫颈癌的发病是多因素及多阶段的，是由炎症到癌前病变恶性演变而来，由于HPV感染、性生活过早、早期筛查率等各种原因，宫颈癌的发病率不断升高，而这种现象主要发生在发展中国家[12-14]。目前宫颈癌的治疗主要包括手术、放化疗，但是早期宫颈癌症状不明显，患者常常延误治疗，另一方面，宫颈癌恶性程度高容易发生局部侵袭和远处转移，因此宫颈癌患者确诊时已由早期进展为晚期宫颈癌，导致患者对上述治疗手段的疗效较差，预后不良[4,5]。有研究报道早期宫颈癌即Ⅰ～Ⅱ期患者5年总生存率为80%左右，而ⅢA期，ⅢB期和ⅣA期患者的5年总生存率分别仅为40%、42%和22%[15]，由此可见宫颈癌新的治疗手段十分重要。分子靶向药物在肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤中取得较好的治疗效果[16,17]，而宫颈癌的确切分子机制的不明确，限制了分子靶向药物疗法的研发。因此本文研究宫颈癌发生发展中发挥重要作用的分子，以期发现宫颈癌潜在的分子靶标，为分子靶向药物治疗宫颈癌提供实验室数据。

随着人类基因组测序高新技术的发展，发现人类基因组总DNA序列中不到2%的基因编码蛋白质，其余98%的序列没有编码蛋白质的功能统称为非编码RNA[18]，而根据序列的长度分为长链和短链非编码RNA，其中miRNA是短链的小RNA，miRNA已被证实在肿瘤中的发病机制中发挥重要作用[19,20]，而通过RNA聚合酶Ⅱ转录产生的lncRNA，是与miRNA具有相似结构的长链RNA，虽然不具有编码蛋白质的功能，但是与miRNA一样通过染色质修饰，转录和转录后调控影响基因的表达[21]，其表达异常可引起多种疾病的发生，Ferguson等[22]报道lncRNA在诱导内毒素血症和心脏代谢疾病等方面具有差异表达。lncRNAs通过调控抗原加工/呈递，免疫细胞增殖和分化以及慢性炎性反应在克罗恩病和溃疡性结肠炎等炎症性肠病的发病机制中发挥重要作用[23]。近年来，lncRNAs在肿瘤中的研究也越来越多，结肠癌患者血浆中LNCV6-116109、LNCV6-98390、LNCV6-38772、LNCV-108266、LNCV6-84003显著上调，可作为早期生物标志物[24]。lncRNA UCA在肺癌细胞中显著上调，UCA1的沉默可通过诱导G2/M细胞周期停滞和凋亡来抑制肺癌细胞的增殖，此外UCA1沉默还可以抑制肺癌细胞的迁移和侵袭[25]。lncRNA LINC01133，长度为1 154 nt，位于染色体1q23.2上，是新近发现的lncRNA，由Zhang等[8]在2015年首次报道LINC01133在肺鳞状细胞癌中高表达；并且LINC01133与黑素瘤的发生率和发展显著相关[26]。而有报道LINC01133在胃癌和结肠癌中低表达，并且低表达与肿瘤的进展和转移相关，在细胞实验中LINC01133抑制肿瘤细胞的侵袭和转移[27,28]。表明LINC01133在不同的肿瘤中的表达及发挥功能不一致，而其在宫颈癌中的表达及作用引起我们的关注。

首先我们检测LINC01133在60例宫颈癌和40例正常宫颈组织中的表达水平，qRT-PCR结果显示LINC01133在宫颈癌组织中的表达显著高于正常宫颈组织，而Huang等[29]采用qRT-PCR检测LINC01133在胰腺导管腺癌和癌旁组织中的表达，同样发现与癌旁组织比较LINC01133在胰腺导管腺癌组织中表达上调。此外，我们分析发现LINC01133的在宫颈癌组织中的高表达与宫颈癌肿瘤大小、肿瘤TNM分期及淋巴结转移显著相关，同时Kaplan-Meier检验发现LINC01133高表达的宫颈癌患者5年总生存期较短。而Mao等[11]采用lncRNA表达谱分析鉴定宫颈鳞癌的预后相关的lncRNAs TCGA数据库，结果显示LINC01133高表达可以预测宫颈鳞癌患者存活率低，与本文的研究结果具有相似性，均能提示LINC01133可能为促癌因子，另外LINC01133在宫颈癌组织中表达升高可能与肿瘤的增殖和转移相关。在肺鳞癌细胞系中划痕实验和transwell实验表明，siRNA对LINC01133的沉默可以抑制细胞的侵袭能力[8]。LINC01133在骨肉瘤组织和细胞系中均表达上调，LINC01133的沉默也可以明显抑制骨肉瘤细胞(HOS和U2-OS)的增殖、迁移和侵袭能力[30]。为研究LINC01133是否与宫颈癌的增殖、转移和迁移有关，在宫颈癌细胞系HeLa、caski和siha及人宫颈上皮永生化细胞H8中检测了LINC01133的表达水平，结果显示LINC01133在宫颈癌细胞系中的表达均增高，与组织中的表达水平具有一致性，其中在HeLa细胞中的表达水平最高，我们同样采用siRNA沉默HeLa细胞中LINC01133的表达后，MTS增殖实验、Transwell实验及划痕实验结果表明抑制LINC01133的表达后，细胞增殖、转移及迁移能力均降低。

干扰宫颈癌细胞中LINC01133的表达后，细胞的恶性生物学行为受到显著的抑制，而其作用的机制需进一步研究。Zheng等[10]报道LINC01133在肝细胞癌(HCC)细胞系中表达上调，其敲低可以抑制HCC细胞增殖、细胞集落形成、G1期阻断细胞周期停滞以及HCC细胞的迁移和侵袭，LINC01133的沉默在细胞系水平和裸鼠皮下移植瘤中均可以抑制PI3K/AKT信号传导途径抑制HCC肿瘤进展。PI3K/AKT是参与肿瘤发生发展的经典信号通路[31]，而PI3K/AKT信号传导在宫颈癌细胞中高度活化，参与宫颈癌的癌变、侵袭转移和耐药[32]。MALAT1通过激活PI3K/AKT途径促进宫颈癌中的顺铂耐药性[33]。lncRNA CRNDE的敲低导致PI3K/AKT途径失活而抑制宫颈癌细胞的增殖[34]。因此我们检测了PI3K/AKT信号通路关键蛋白的表达变化，Western-blot检测si-LINC01133组pPI3K和pAKT蛋白表达水平显著下降，表明沉默LINC01133的表达可能通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制宫颈癌增殖转移，其作用具的体机制需在后续研究中进行深入探讨。

综上所述，LINC01133在宫颈癌组织和细胞中均高表达，其高表达与宫颈癌患者的肿瘤直径大、TNM分期晚期、淋巴结转移及不良预后显著相关，沉默LINC01133可能通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制宫颈癌的恶性行为，LINC01133可能为治疗宫颈癌的潜在靶点。