王鹭，张迪，曹峰

抑郁障碍以显著而持久的心境低落为主要临床特征;研究[1]显示，抑郁障碍患者的伤残损失寿命年(YLD)在全球十大致残疾病中居首位；迄今病因不清楚。临床上以描述性诊断为主，尚没有明确的实验室客观指标。深入研究[2-5]发现，无论是抑郁障碍动物模型或患者的脑组织、外周血单核细胞(PBMC)中均有微小(mi)RNA表达异常；抑郁障碍的病理生理过程与miRNA功能失调或应答改变密切相关。动物实验[6-7]已证实miRNA-16可抑制5-羟色胺(5-HT)转运蛋白的表达；下调中缝核miRNA-16表达可改善抑郁症状；且氟西汀可降低大脑中缝的 miRNA-16 浓度，间接影响5-HT 神经元的合成及功能，保证了神经元的正常功能，使抑郁症状得到改善。经本院伦理委员会批准，本研究动态检测接受帕罗西汀治疗的初发抑郁障碍患者PBMC miRNA-16 的表达水平，探讨其对抑郁障碍诊断及评估病情的价值。

1 对象和方法

1.1 对象

患者组：为本院2017年1月至2019年1月在本院治疗的18～60岁首发抑郁障碍患者150例；入组者均符合《美国精神障碍诊断与统计手册》第4版(DSM-IV)抑郁障碍诊断标准；汉密尔顿抑郁量表17项版本(HAMD-17)评分>17分；病程<3个月、且未曾服抗抑郁药；排除患有癫痫、严重躯体疾病及其他精神疾病、物质依赖、严重自杀企图及行为的患者。所有患者都由家属签属知情同意书。治疗过程中因各种原因中途退出24例，完成观察126例，其中男59例，女67例；年龄(43.4±18.5)岁。对照组：同期选取与患者组性别、年龄相匹配的本院健康医护人员30名，均无抑郁障碍及其他精神疾病家族史，其中男14名，女16名；年龄(43.1±17.8)岁。两组性别、年龄方面比较差异无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 药物治疗方法 患者入组后即接受帕罗西汀片(天津中美史克制药公司)单药治疗，初始剂量20 mg/d，根据病情变化调整剂量，最大剂量≤40 mg/d，疗程8周；平均剂量(28.52±5.94)mg/d。

1.2.2 疗效评价方法 分别于治疗前、治疗第1、2、4、8周给予患者HAMD-17评估，以治疗结束时HAMD减分率将患者分组，减分率≥75%为A组；50%～74%为B组，25%～49%为C组，<25%为D组。

1.2.3 PBMC miRNA-16水平检测 患者组分别于治疗前、治疗后第1、2、4、8周及对照组入组时抽取留取外周静脉血4 ml，枸橼酸钠抗凝；采用密度梯度离心法分离外周血单核细胞，用RNA提取试剂盒(miRNeasy Mini Kit)提取总RNA，荧光定量PCR法检测miRNA-16表达量；用FICOLL-PAQUE分离液分离PBMCs；总RNA提取严格按照miRNeasy Mini Kit说明书上步骤实施；cDNA的合成按以下配方配置反应液：5×RT缓冲液2 μl，模板RNA X μl，miR-16反转录引物0.5 μl，AMV Reverse Transcriptase 0.5 μl， dNTP Mixture 1 μl，RNase inhibitor 0.5 μl，RNase free H2O 5.5-X μl；总体积10 μl。配好的反应液置于PCR仪中45℃反应45 min；后调至95℃反应5 min；最后冰浴5 min。将合成的cDNA置于-20℃冰箱中保存。Real-time PCR配置体系：cDNA模板 4 μl，PCR Forward primer 1 μl，PCR Reverse primer 1 μl，2×SYBR Green mix 25 μl， Tap DNA Polymerase 0.3 μl，ddH2O 18.7 μl。PCR循环条件94℃ 2 min→94℃ 10 s→60℃ 15 s →72℃ 30 s；40个循环。荧光信号采集在每循环第3步反应时；荧光定量PCR的结果以每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数Ct表示。miRNA-16与U6(反转录引物)相对表达量用2-ΔΔCt值表示。

2 结果

2.1 两组PBMC miRNA-16表达比较

治疗前患者组PBMC miRNA-16相对表达量明显高于对照组(P<0.01)；随着治疗进行患者组PBMC miRNA-16相对表达量逐渐下降(P<0.01)；但各时间点仍明显高于对照组(P<0.05或P<0.01)。见表1。

表1 两组PBMC miRNA-16表达水平的比较值)

2.2 患者组亚组间PBMC miRNA-16表达比较

治疗前亚组间PBMC miRNA-16相对表达量差异无统计学意义；治疗后各亚组miRNA-16表达明显低于治疗前(P均<0.01)，呈现D组>C组>B组>A组，差异有统计学意义(P均<0.01)。见表2。

表2 亚组间PBMC miRNA-16表达比较值)

2.3 患者组PBMC miRNA-16表达水平与HAMD评分的相关性分析

患者组miRNA-16表达水平与HAMD评分呈正相关性(r=0.432，P=0.000)。见图1。

图1患者PBMC miRNA-16表达与HAMD评分相关性分析

3 讨论

迄今为止，抑郁障碍的病因并不清楚，多年来一直停留在描述性诊断阶段，阻碍了抑郁障碍的有效治疗和后期康复。但可以肯定的是，生物、心理与社会环境诸多方面因素参与了抑郁障碍的发病过程；生物学因素主要涉及遗传、神经生化、神经内分泌、神经再生等方面。miRNA是一类长度为18～25个核苷酸的内源性非编码RNA，广泛存在于真核生物中，参与调控细胞生长、分化和凋亡等各个环节。研究[8]表明miRNAs转录后对基因调控功能的异常与神经精神疾病的发生、发展过程有着密切关系。有研究[9]认为 PBMC miRNAs异常表达可能参与了抑郁障碍的发病机制；袁梅菊等[10]研究显示，抑郁障碍患者PBMC表面miRNA-124表达水平与抑郁障碍的诊断、治疗效果关系密切；可作为抑郁障碍诊断和评估预后的生物学标记物。

miRNA可能参与抑郁症的发病的机制有：①单胺机制：单胺神经递质如5-羟色胺(5-HT)、多巴胺和去甲肾上腺素等功能低下与抑郁症的抑郁心境、运动抑制、焦虑不安、睡眠障碍、不能应对刺激及内分泌功能失调等症状有关[11-13]，作为抑郁症情绪调控异常机制的候选基因，5-HT2A基因主要对额叶功能异常造成影响[14]，miR-195 在转录后参与了该基因的调控。Launay等[15]发现5-HT转运蛋白表达被miR-16所抑制，研究通过下调中缝核miR-16表达使抑郁症状大大改善。②神经营养因子机制：miR-132、miR-195既可调控5-HT受体，也参与调控脑源性神经营养因子(BDNF)和谷氨酸受体。针对抑郁大鼠模型进行的研究[16]显示，额叶皮质miR-22、miR-200b、miR-211和miR-300可能通过抑制cAMP反应结合蛋白 (CREB)表达，使大鼠神经突触减少及树突棘形态异常来参与抑郁症的病理生理过程。

对抑郁症药物研究[6-7]发现，在针对大鼠的实验中，长期给予氟西汀会降低大脑中缝的 miR-16 浓度，同时降低了5-HT 转运体(SERT)蛋白水平。SERT 是5-HT 再摄取抑制剂(SSRI)最为重要的作用靶点。在氟西汀药物的作用下，5-HT 神经元能释放神经营养因子，其通过降低 miR-16 表达对去甲肾上腺素能神经元发挥作用，进而影响SERT蛋白表达，间接影响5-HT 神经元的合成及功能，保证神经元的正常功能，改善了抑郁症状。

本研究中，治疗前患者PBMC miRNA-16表达水平明显高于对照组，随着治疗进行，PBMC miRNA-16表达水平逐渐下降，但各时点仍显著高于对照组；提示PBMC miRNA-16表达水平可能是抑郁障碍的生物标志物之一。进一步观察发现，治疗前不同疗效组患者PBMC miRNA-16表达水平无明显差异，治疗后均较治疗前明显降低(P均<0.01)；治疗后PBMC miRNA-16表达水平呈现D组>C组>B组>A组，差异有统计学意义(P均<0.01)；相关性分析显示，患者miRNA-16表达水平与HAMD评分呈正相关(r=0.432，P=0.000)；提示PBMC miRNA-16表达水平或许可作为评估抑郁障碍患者病情的生物标记物之一。