吕英超，吴范武，张晓峰，王迎寒△

（1河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院中药研究所，河北 承德；2唐山华北理工大学中医学院，河北 唐山）

0 引言

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)属于慢性功能性胃肠病，其在临床中较为常见，主要以腹部不适和腹痛并且多伴有排便习惯改变为特征，又是一种缺少形态学、生化异常改变的症候群，并伴有紧张、焦虑等精神症状[1,2]。腹泻型肠易激综合征(diarrhea-predominant IBS，D-IBS)发病率较高，约占IBS的40.83%[3]。水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是生物膜上的一类特异性膜蛋白，广泛分布于身体各部位，与水的跨膜转运有着密切联系[4]。近年研究发现，D-IBS患者及动物模型的结肠黏膜上皮细胞AQPs表达有明显改变[5]。其中研究发现AQP3即参与结肠黏膜处水液的转运，也影响其黏膜下层等处的水液转运，AQP3表达降低后影响了结肠内水液转运，可能导致D-IBS模型大鼠出现腹泻的症状[5]。大量研究发现，AQP4表达水平的高低也可以影响结肠水液吸收，是腹泻症状发生的重要因素[6,7]，所以本课题通过对D-IBS大鼠模型采取灌服番泻叶联合束缚应激的方法进行复制，同时使用健脾化湿颗粒进行干预，以检测大鼠结肠黏膜水通道蛋白3、水通道蛋白4的表达，以此来阐明该颗粒的作用机制。

1 材料

1.1 动物

选取的实验动物为SD雄性大鼠，共60只，级别为SPF级，体重(250±20)g，购自北京维通利华生实验动物技术有限公司，合格证号SCXK(京)2012-0001。在进行实验前的1周先对大鼠进行饲养，使其在承德医学院屏障环境动物实验室中进行饲养，使其能够适应这种环境。本动物实验经承德医学院伦理委员会批准进行，批准编号CDMULAC-2014-003。

1.2 药物及试剂

番泻叶(安国市昌达药业有限公司，批号1305001)，由承德医学院中药研究所植化室赵春颖教授鉴定为豆科植物狭叶番泻Cassiaangustifolia的干燥小叶。匹维溴铵(得舒特，法国苏威特药品公司，批号635375);健脾化湿颗粒，该颗粒的药物有炙黄芪、益智仁、炒白术、茯苓、砂仁、乌药、陈皮、炒白芍、防风、炙甘草，按照一定的比例进行配伍，并使用低温动态的方法进行提取，并采取冰冻浓缩、喷雾干燥的方法进行制备，最后以干法制粒而制成，是由承德医学院中药研究所提供；AQP3抗体，AQP4抗体，羊抗兔IgG，山羊抗兔免疫球蛋白(IgG)/辣根过氧化物酶(HRP)二抗，兔抗β-肌动蛋白(β-actin)(北京博奥森生物技术有限公司，货号分别是bs-1253R，bs-10713R，bs-0061R，bs-0295G-HRP，bs-0061R)；sp rabbit HRP kit(DBA试剂盒)(北京康为世纪生物科技有限公司，批号 54140)。

1.3 仪器

BX53型显微医学影像工作站(日本奥林巴斯有限公司)；Sceintz-48型高通量组织研磨器(宁波新芝生物科技股份公司)；Velocity18r型台式高速冷冻离心机(澳大利亚Dynamica公司)；KD-2258型组织切片机，KD-P 型摊片机，KD-BMⅢ型生物组织冷冻包埋机，KD-TS3A型自动组织脱水机(浙江省金华科迪仪器设备有限公司)；GZX-9240MBE型电热鼓风干燥箱(上海博远实业有限公司)。

2 方法

2.1 药物的配制

2.1.1 番泻叶的水浸液

摘捡干净的番泻叶，将其放于沸水中进行浸泡，时间为30min，并使用双层的纱布进行过滤，将药渣再次放入沸水中浸泡，时间为20min，再使用双层的纱布进行过滤，之后将滤液合并进行减压浓缩，制得生药0.3g·ml-1的药液，将其放于温度为4℃环境中进行保存。

2.1.2 健脾化湿颗粒

使用0.9%的生理盐水将健脾化湿颗粒进行溶解，分别按照药物的浓度配成0.625、1.25、2.5g·ml-1的药液，放于温度为4℃环境下进行保存。

2.1.3 阳性药

使用0.9%的生理盐水对碾碎后的匹维溴铵药片进行溶解，将其制成3g·L-1的混悬药液，放于温度为4℃的环境下进行保存，注意在使用之前应进行摇匀。

2.2 D-IBS大鼠模型的复制

药物干预60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、匹维溴铵药组、健脾化湿颗粒低、中、高剂量组，共6组，每组10只。将大鼠进行1周的饲养使其适应环境后进行模型的复制：所有大鼠在进行实验之前均禁食12h，饮水可自由，正常组的大鼠不用番泻叶灌胃，其余各组大鼠分别给番泻叶水浸液(3g·kg-1)灌胃，次/d，连续灌胃14d。14d后对大鼠灌胃完成后将前上肢使用透明的胶带进行束缚，胸部和肩部时间为1h，次/d，持续进行14d；正常组的大鼠在整个过程中只使用生理盐水灌胃，剂量均为10ml·kg-1，且该组的大鼠每天只进行生理盐水灌胃处理；模型组的大鼠是在进行束缚完成后给予生理盐水进行灌胃；匹维溴铵组大鼠是在束缚完成后给予匹维溴铵(0.03g·kg-1)灌胃；低、中、高剂量组的大鼠在束缚完成后分别给低、中、高剂量的健脾化湿颗粒药液灌胃，剂量分别为6.25、12.5、25g·kg-1，在使用过程中的剂量与成人的剂量是等效的。

2.3 取材与处理

药物干预14d，最后1次给药后禁食12h，立即处死大鼠，取若干小段的结肠组织。在每组中抽取6只大鼠的一段结肠组织，并使用4%多聚甲醛进行固定后做脱水、石蜡包埋、切片处理，用作免疫组织化学染色检测AQP3和AQP4表达。

2.4 各组大鼠在结肠中AQP3和AQP4的表达

使用的检测方法为免疫组织化学法。对结肠组织进行切片，常规方法脱蜡至水，在温度为95℃-98℃下进行抗原修复，时间为30min，先在37℃山羊血清中进行封闭处理，时间为30min，之后进行一抗在温度为4℃的环境下进行孵育(一抗1:200，PBS作为阴性对照)过夜，二抗在37℃环境下进行孵育，时间为2h，DAB显色，在镜下进行观察并控制好显色时间。当胞浆中出现棕黄色的反应物时则表明出现了阳性反应，颜色越深则说明出现的阳性反应越大；若没有出现棕黄色的反应物则说明为阴性。随机选取每张片子6个不相互重叠的×400视野进行拍照，用Image-pro plus(IPP)图像分析软件，对照片进行半定量分析并计算积分吸光度IA，其均值作为该大鼠AQP3和AQP4表达的数值。

2.5 统计学分析

数据使用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料使用s表示，并进行t检验，组间差异有统计学意义则使用P＜0.05表示。

3 结果

在各组结肠中AQP3和AQP4的表达变化：与正常组比较，模型组大鼠结肠中AQP3和AQP4表达显著下降(P＜0.01)。与模型组比较，低、中、高剂量组及匹维溴铵组大鼠结肠中AQP3和AQP4表达显著升高(P＜0.05，P＜0.01)。与匹维溴铵组比较，中剂量组和高剂量组大鼠结肠中AQP3和AQP4表达显著升高(P＜0.05，P＜0.01)。见表1。

表1 健脾化湿颗粒对D-IBS大鼠结肠中AQP3和AQP4表达的影响，n=3）

表1 健脾化湿颗粒对D-IBS大鼠结肠中AQP3和AQP4表达的影响，n=3）

组别 剂量/g·kg-1 AQP3 AQP4正常对照组 - 0.4067±0.0068 0.4596±0.0072模型组 - 0.1851±0.0035 0.1702±0.0099匹维溴铵组 0.03 0.3042±0.0064 0.2876±0.0156低剂量组 6.25 0.3548±0.0066 0.2669±0.0071中剂量组 12.5 0.3972±0.0109 0.3145±0.0119高剂量组 25 0.4388±0.0063 0.3934±0.0131

4 讨论

健脾化湿颗粒源于临床验方，方内含痛泻要方的成分，意在调和肝脾，补脾柔肝，健脾胃理顺气，能够祛湿止泻。其主要是用来治疗脾虚湿盛肝旺之泄泻，对于腹泻型肠易激综合征有很好的疗效。本实验所采用的D-IBS大鼠模型是通过灌服番泻叶联合束缚应激法建立[8]，中医学中此模型属于脾虚肝郁证型，即脾虚在前、肝郁在后、土虚木乘从而形成脾虚肝郁证；治疗原则是健脾益气为主，理气疏肝为辅[9]。

前期研究证实[9-12]，本方对脾虚型肠易激综合征模型大鼠稀便级异常、内脏高敏感有很好的治疗作用，能明显改善模型大鼠结肠组织中NO、NOS、CGRP的水平及5-HT、CRF及其受体的表达量。本实验主要采用免疫组化的方法检测AQP3、AQP4蛋白表达，结果显示，模型组AQP3、AQP4表达显著降低，说明两者在D-IBS腹泻发病过程中起重要作用;经健脾化湿颗粒治疗后，AQP3、AQP4的表达显著升高，提示健脾化湿颗粒通过升高模型大鼠结肠部位AQP3和AQP4表达，提高结肠水液吸收能力从而改善D-IBS腹泻症状，说明这可能是健脾化湿颗粒治疗D-IBS腹泻症状的作用机制之一。