顾依静,武 丹,祝德秋

(同济大学附属同济医院药剂科,中国上海200065)

气体信号分子(gasotransmitter,gaseous signal molecule)是一类能够自由穿透细胞膜、具有特定生理学功能和作用靶点、由酶促反应生成、受体内代谢途径调控的内源性气体分子[1]。1987年,研究证实一氧化氮(nitric oxide,NO)是一种具有舒张血管效应、由血管内皮细胞释放的信使分子[2]。随后相继有研究报道,在哺乳动物体内存在内源性一氧化碳(carbon monoxide,CO)[3]和硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)[4]。内源性CO由血红素通过酶促反应代谢生成,而内源性H2S通过催化含硫氨基酸反应生成。气体信号分子具有抗炎[5]、抗氧化[6]、抑制细胞凋亡[7]、舒张血管[8]、保护心脏[9]等作用。心血管系统(cardiovascular system,CVS)疾病具有较高的发病率和致死率[10]。心脏作为为血液流动提供动力的重要器官,需要消耗大量腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP),这些能量由心肌细胞线粒体的氧化磷酸化提供。因此,线粒体在维持心肌细胞正常生理功能中发挥着重要作用,其功能紊乱会导致多种CVS疾病的发生[11～14]。气体信号分子可对线粒体的呼吸作用、线粒体的融合与分裂、线粒体自噬,以及活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成等方面进行调控,从而介导线粒体功能,使心肌细胞维持正常的生理功能。本文主要介绍3种气体信号分子对CVS线粒体的调节。

1 气体信号分子的生物合成与代谢

1.1 NO的生物合成与代谢

在生物体内,一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)以左旋精氨酸为底物,通过酶促反应生成NO和瓜氨酸。NOS可分为钙依赖性NOS和非钙依赖性NOS。钙依赖性的神经元型NOS(neuronal NO synthase,nNOS)和内皮型NOS(endothelial NO synthase,eNOS)受钙离子-钙调节蛋白调控。在CVS中,心肌细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞内都有钙依赖性NOS表达。在心脏内,eNOS主要表达于冠状动脉和心脏内皮细胞,nNOS主要表达于心肌细胞[15]。诱导型NOS(inducible NO synthase,iNOS)属于非钙依赖性NOS,由感染和炎症等机体防御反应激活[16]。大部分NO在体内经代谢生成NO2-和NO3-,只有小部分以原型随肺呼气排出[17]。

1.2 CO的生物合成与代谢

内源性CO由血红素经血红素氧合酶(heme oxygenase,HO)分解生成,同时生成副产物亚铁离子和胆绿素。HO是一种能够限制血红素降解速率的酶,有3种同工酶,即HO-1、HO-2和HO-3。内源性CO主要由HO-1和HO-2催化生成。HO-1为诱导型HO,是一种分布广泛、具有细胞保护作用的热休克蛋白,在正常生理水平下表达较低,可被氧化应激、缺氧、高体温、重金属、紫外线、血红素异常升高等外界刺激信号诱导[18]。HO-2和HO-3为结构型HO,HO-2主要表达于中枢神经系统；HO-3的活性较弱,目前尚未明确其生物学作用。CO可在细胞呼吸过程中被细胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase,CcOX)氧化生成二氧化碳,也可直接经肺排出体外[19]。

1.3 H2S的生物合成与代谢

在哺乳动物体内存在着3种与H2S生成相关的酶,即胱硫醚β合成酶(cystathionine β-synthase,CBS)、胱硫醚 γ 裂解酶(cystathionine γ-lyase,CSE)和3-硫基丙酸硫基转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST)。CVS中的H2S由CSE和3-MST催化生成。CSE通过催化左旋半胱氨酸或同型胱氨酸生成H2S,而3-MST以半胱氨酸氨基转移酶和半胱氨酸的代谢产物3-巯基丙酮酸为底物产生H2S。H2S的体内代谢途径主要有以下3种:1)在线粒体硫醌氧化还原酶(sulfide quinone oxidoreductase,SQR)、S-双加氧酶和S-转移酶的作用下,被氧化生成S2O32-,再经氰化物硫转移酶催化生成SO32-,最后被亚硫酸盐氧化酶氧化成SO42-,由肾脏随尿排出；2)在细胞质硫醇S-甲基转移酶的作用下,生成甲硫醇和二甲硫醚；3)与高铁血红蛋白作用生成硫血红蛋白[20]。

2 气体信号分子对心血管系统线粒体的作用

线粒体是细胞进行有氧呼吸、产生ATP的场所,其通过氧化磷酸化为细胞提供能量的同时产生活性氧。在病理状态下细胞内ROS过量产生并蓄积,使线粒体功能发生紊乱,诱导细胞死亡[21]。在CVS中,线粒体的功能异常能引起动脉粥样硬化[11]、高血压[12]、心力衰竭[13]、糖尿病性心肌病[14]等疾病的发生。气体信号分子主要通过调控线粒体的呼吸作用、活性氧生成、线粒体融合与分裂、线粒体自噬来介导线粒体功能,使心肌细胞维持正常生理功能。

2.1 对线粒体呼吸作用的影响

在细胞有氧呼吸中,各电子载体在传递电子的过程中依次被氧化,最终生成ATP,该过程发生在线粒体内,被称为线粒体电子传递链(electron transport chain,ETC)。ETC包括复合物Ⅰ～Ⅴ5个线粒体呼吸链酶复合物,以及辅酶Q和细胞色素c两种电子传递体。复合物Ⅳ,即CcOX,是ETC中的最后环节。在CcOX的催化下,电子从还原型的细胞色素c传递至分子氧,生成水[22]。CcOX是气体信号分子抑制线粒体呼吸作用的主要靶点,3种气体信号分子都能够通过CcOX途径减少耗氧以及ATP的生成[23]。

NO与CcOX结合形成亚硝酰基衍生物(CcOX-NO)或亚硝酸盐衍生物(CcOX-NO2-),随后再与CcOX血红素a2结合,从而抑制线粒体呼吸。线粒体呼吸受抑制的程度与NO、细胞色素c和O2的浓度有关[24]。在腹主动脉缩窄术(transverse abdominal aortic constriction,TAC)构建的大鼠心肌肥厚模型中,肥厚心肌细胞内iNOS上调,引起NO水平升高,CcOX活性受到抑制,加上肥厚心肌细胞线粒体对CcOX抑制的敏感性,使其更易缺乏ATP并诱发充血性心力衰竭[25]。

CO与分子氧竞争血红素a3结合位点,抑制线粒体呼吸,减少ATP生成[26]。Wang等[27]通过对心肌细胞特异性HO-1过表达小鼠进行冠脉结扎构建了心力衰竭小鼠模型,发现心肌细胞HO-1以CO依赖方式抑制线粒体呼吸,并减少线粒体膜通透性转换(mitochondrial permeability transition,mPT)。

高浓度的H2S与分子氧竞争结合CcOX,使线粒体内膜电势消失,引起细胞有氧呼吸中止,从而对哺乳动物产生可逆的急性毒性；而低浓度的H2S对CcOX的抑制为非竞争性的[28]。Sun等[29]在大鼠乳鼠心肌细胞中发现,使用外源性H2S预处理能够抑制缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)条件下线粒体CcOX的活性。但也有报道指出,H2S能促进线粒体呼吸,H2S对线粒体的呼吸具有双重作用。在纳摩尔到低微摩尔的水平下,H2S作为电子供体被SQR氧化,促进线粒体呼吸[30]。在高同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)血症的大鼠模型中,线粒体呼吸受到抑制,但腹腔注射饱和H2S溶液可拮抗Hcy在CVS的生物学效应,恢复心肌细胞线粒体琥珀酸脱氢酶和CcOX活性,促进线粒体呼吸[31]。

2.2 对活性氧生成的影响

ROS由线粒体的ETC和三羧酸循环产生,是生物体内一类具有较强氧化性和生物学活性的含氧化合物,包括超氧阴离子自由基、过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)、羟自由基、单线态氧等。在病理状态下,细胞内ROS过量产生并在细胞内不断蓄积,破坏细胞内氧化与抗氧化作用间的平衡,引起氧化应激,诱导细胞发生死亡级联反应[32]。

氧化应激是心肌发生缺血-再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,I/R injury)的主要原因之一。Hou等[33]合成了一种能够在超氧阴离子自由基介导下靶向线粒体,并且原位释放NO的新型供体MitoSNOD,同时证实MitoSNOD预处理可在体内显著抑制I/R损伤诱导的线粒体膜电位降低,保护H9c2细胞,显著减少Langendorf灌注的离体大鼠心脏中平均梗塞面积。

Yao等[34]证实CO释放分子2(CO releasing molecule 2,CORM2)可改善心脏骤停后复苏大鼠的心脏功能,减轻心肌线粒体ROS生成和氧化应激,减少线粒体及心肌细胞损伤；在体外实验中,低浓度CORM2(20 mmol/L)对线粒体呼吸产生轻度的解偶联作用,减少线粒体ROS生成,该效应可能由CORM2释放的CO所介导。

我们的研究表明,H2S通过SIRT1途径可剂量依赖性地保护H9c2细胞,使其免受H2O2诱导的氧化应激损伤,减少ROS生成,抑制H9c2细胞凋亡[35]。在生物体内,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是一种能够在抵御ROS损伤中发挥重要作用的抗氧化金属酶,包括Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD 三类。Sun等[29]在外源性H2S供体NaHS预处理的大鼠乳鼠心肌细胞中发现,H2S在抑制线粒体CcOX的同时,增加Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的活性,从生成和清除两种途径对ROS进行调控,减少H/R条件下心肌细胞内ROS的水平。在血管紧张素Ⅱ诱导的肥大心肌细胞中,NaHS通过促进SIRT3的转录和表达减弱心肌细胞肥大,改善心肌细胞的线粒体功能,增加Foxo3a和Mn-SOD的表达,抑制心肌细胞氧化[36]。Foxo3a能够增加抗氧化酶活性,降低细胞内ROS水平[37]。此外,过量的ROS还可使线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)病理性开放,发生mPT和线粒体肿胀,继而引起细胞死亡[38]。Karwi等[39]发现,靶向线粒体的H2S供体AP39剂量依赖性地抑制线粒体膜通透性转换孔开放,抑制心肌细胞肌纤维膜下线粒体和肌纤维间线粒体的ROS生成,可预防和缓解I/R损伤导致的心肌梗死。

2.3 对线粒体质量控制的影响

线粒体暴露于高水平的ROS中易发生线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)突变和蛋白质折叠错误,导致线粒体功能障碍[40]。线粒体通过质量控制保持数目和质量稳定,从而保证线粒体和细胞的生理功能。线粒体的质量控制主要包括线粒体的生物合成、线粒体的分裂与融合以及线粒体自噬。

2.3.1 对线粒体生物合成的影响

线粒体的生物合成是从已有的线粒体中进行增殖的过程,需要核基因组与mtDNA共同参与。线粒体的生物发生能够限制突变mtDNA的转录和表达,使线粒体维持正常的生命活动[41],该过程受到过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α (peroxisome proliferator-activated receptorγ coactivator-1α,PGC-1α)的调控。PGC-1α 通过刺激下游的核呼吸因子1/2(nuclear respiratory factor 1/2,NRF1/2),激活线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM或mTFA),促进线粒体DNA转录,增加线粒体的生物合成[42]。调控线粒体生物合成的另一条途径是腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)途径。AMPK通过激活PGC-1α增加线粒体的生物合成,同时AMPK的活性可被蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)抑制。

内源性H2S能够抑制PP2A,正向调控AMPK,诱导PGC-1α信号,增加心脏线粒体的生物合成；在心力衰竭状态下,使用外源性H2S供体SG-1002可恢复H2S水平,增加心脏线粒体含量和ATP生成,改善线粒体呼吸,从而改善心功能[43]。

Hull等[44]用多柔比星处理野生型和HO-1转基因小鼠,诱导其心肌细胞线粒体功能发生障碍,结果显示心脏特异性HO-1过表达可使PGC-1α、NRF1和TFAM的表达增加,同时增加线粒体DNA合成酶Polγ的表达,进而促进线粒体的生物合成。Piantadosi等[45]报道,HO-1过表达产生的内源性CO,通过诱导NRF2的基因表达与核转运,上调NRF1的mRNA和蛋白质水平,从而激活线粒体生物合成。

研究报道,线粒体内活性氧增加,使线粒体发生损伤,活性降低,同时线粒体生物合成减弱,ATP生成减少[46]。但也有研究表明,线粒体的生物合成可通过活性氧途径激活[47]。Suliman等[48]发现适度增加细胞CO浓度,可使线粒体通过产生H2O2、活化鸟苷酸环化酶和丝/苏氨酸蛋白激酶Akt、诱导HO-1等途径激活生物发生,在该过程中内源性CO和外源性CO之间具有协同作用,而且这种作用可能与血红素的转化率和清除率有关。

2.3.2 对线粒体融合/分裂以及自噬的影响

线粒体通过不断的分裂与融合,使其数量保持动态平衡,维持其在细胞内的正常生理功能,该过程称为线粒体动力学。对于衰老或受损的线粒体,线粒体可通过自噬途径将其清除,保持细胞内线粒体质量稳定。线粒体融合蛋白1(mitofusin 1,MFN1)、线粒体融合蛋白2(mitofusin 2,MFN2)、视神经萎缩蛋白1(optic atrophy 1,OPA1)是调控线粒体融合的蛋白质,其中MFN1和MFN2位于线粒体外膜,OPA1位于线粒体内膜；而动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1)、线粒体分裂蛋白1(fission 1,FIS1)、线粒体裂变因子(mitochondrial fission factor,MFF)是介导线粒体分裂的蛋白质[49]。调控线粒体自噬的通路包括PTEN诱导的假定激酶1(PTEN induced putative kinase,PINK1)/E3泛素连接酶Parkin通路、BCL2和腺病毒E1B 19 kD相互作用蛋白3/Nip3样蛋白X(BCL2 and adenovirus E1B 19 kD interacting protein 3/Nip3-like protein X,BNIP3/NIX)通路以及FUN14结构域蛋白1(FUN14 domain containing 1,FUNDC1)通路[40]。

Miller等[50]用NOS抑制剂L-NAME对SD大鼠进行处理,发现OPA1、MFN1、MFN2的表达降低,DRP1含量增加,但NOS抑制剂对线粒体自噬的影响较小,仅BNIP3略有下降,而自噬相关蛋白质Beclin1、p62的水平以及 LC3B2与LC3B1的比值均未发生显著变化。

Hull等[44]发现在多柔比星诱导的心肌细胞线粒体功能障碍模型中,HO-1过表达会抑制线粒体中FIS1的上调,增加MFN1和MFN2的表达以及PINK1的表达,从而减少多柔比星诱导的线粒体损伤和mtDNA缺失。

Meng等[36]在TAC引起的心肌肥大小鼠模型中发现,H2S外源性供体NaHS能够增加MFN1、MFN2和OPA1的表达,同时减少DRP1和FIS1的表达,该作用依赖于组蛋白去乙酰化酶SIRT3。Lencel等[51]在代谢综合征小鼠模型中发现,外源性CO供体CORM3部分逆转了高脂饮食所诱导的线粒体融合相关mRNA Mfn2和Opa1的增加,抑制了PGC-1α、NRF1和TFAM的升高,增加了自噬标记物LC3-Ⅱ,逆转了代谢综合征所诱导的心功能不全。在高糖诱导的H9c2细胞损伤中,MFN2表达增加,但在外源性H2S供体GYY4137给予48 h后,MFN2表达降低,H9c2细胞凋亡减少[52]。Liu等[53]在高糖高脂的大鼠主动脉内皮细胞中发现,外源性H2S可促进PINK1对Parkin的招募,通过Parkin/PINK1途径增加线粒体自噬,促进受损线粒体的清除。

3 气体信号分子间的相互作用

近年来,越来越多的证据表明气体信号分子之间存在着相互作用。气体信号分子通过影响蛋白质的翻译后修饰,或影响另一种气体信号分子的生物合成,产生相互协同或抑制的作用。在CVS中,气体信号分子间的相互作用集中于NO和H2S之间,二者作用相互协同。

3.1 影响蛋白质的翻译后修饰

气体信号分子与蛋白质上的残基发生可逆的共价结合,改变蛋白质的结构和功能,该过程属于蛋白质翻译后修饰的一种。NO对蛋白质半胱氨酸(cysteine,Cys)残基进行修饰,将Cys上的巯基-SH转变成-SNO的过程,称为巯基亚硝基化(S-nitrosylation,SNO)；H2S也能对蛋白质进行类似的修饰,使-SH转变成-SSH,称为硫巯基化(S-sulfhydration,SSH)[54]。气体信号分子通过介导其他气体信号分子对蛋白质进行翻译后修饰,从而实现对信号转导的干预。Sun等[55]发现,在再灌注过程中给予H2S的外源性供体NaHS,能够增加心脏保护相关蛋白质的巯基亚硝基化,显著降低缺血后心脏收缩功能障碍和梗死面积；将NaHS与NO供体SNAP联用能进一步增加巯基亚硝基化程度,从而获得额外的心脏保护作用,且作用大小与-SNO的增加程度相关。Lin等[56]发现,在动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠模型中,H2S上调了主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)NO和蛋白质巯基亚硝基化水平,缩小了粥样硬化斑块面积；在用氧化低密度脂蛋白诱导的VSMC中,H2S能够显著逆转iNOS表达和NO生成的减少,同时剂量依赖性地提高VSMC中蛋白质巯基亚硝基化水平,抑制VSMC的增殖和迁移。

3.2 影响气体信号分子的生物合成

气体信号分子还能影响彼此的生物合成。H2S可通过增加NO的生物合成,使心肌免受I/R损伤。Kondo等[57]在TAC诱导的心力衰竭小鼠中发现,H2S通过促进VEGF-Akt-eNOS-NO-cGMP信号传导,增强了eNOS Ser1177的磷酸化修饰,缓解了线粒体呼吸功能障碍,减轻了氧化应激损伤,增加了心肌血管密度。Minamishima等[58]对心脏骤停小鼠注射H2S供体Na2S后进行心肺复苏,结果显示H2S通过eNOS依赖性途径,增加了左心室和脑皮层eNOS的磷酸化,升高了血清亚硝酸盐和硝酸盐水平,减轻了心脏骤停引起的线粒体损伤和细胞死亡。Jin等[59]在L-NAME诱导的高血压性心脏病大鼠中发现,外源性H2S通过激活Akt/eNOS/NO途径,提高了血浆NO浓度和左心室组织中NOS的活性,升高了Ser1777磷酸化eNOS和Ser473磷酸化Akt的蛋白质水平,改善了LNAME引起的心脏重塑和功能障碍。

4 总结与展望

随着对气体信号分子在心血管系统中生物学机制的研究,人们发现内源性NO、CO和H2S通过对线粒体的呼吸作用、融合与分裂、自噬以及活性氧生成等方面进行调控,发挥抑制线粒体损伤、减轻氧化应激、促进细胞存活的作用,从而维持心肌细胞的生理功能,抑制心力衰竭、心肌肥厚、缺血-再灌注损伤、动脉粥样硬化等病理过程的发生与发展。尽管越来越多的证据表明,在心血管系统中不同气体信号分子之间存在着相互作用,但它们相互作用的确切机制尚未完全阐明。同时,NO和H2S进行翻译后修饰的靶点都是蛋白质的半胱氨酸残基,二者在修饰同一靶蛋白时的竞争机制尚不明确。此外,气体信号分子通过翻译后修饰改变靶蛋白活性的机制也需要进一步研究。总之,揭示气体信号分子在心血管系统中的相互作用,有助于明确其在生理及病理过程中的作用机制,从而为心血管疾病的防治提供新的科学依据。

此外,气体信号分子的临床治疗前景也日益得到重视,各类气体信号分子已成为近年来的热门研究领域。除了心血管系统外,气体信号分子在泌尿系统、消化系统、呼吸系统等系统中也能发挥作用。由于其广泛的生物学效应,所以在治疗过程中,气体信号分子不仅会作用于靶器官,也会影响其他系统的生理病理过程,导致脱靶效应。脱靶效应,即产生与治疗作用无关的副作用,甚至是对机体造成不可逆损害的毒性反应。因此,研究气体信号分子在心血管线粒体的靶点和分子作用机制,有助于明确将其用于动物体内时可能出现的不良反应,从而有针对性地进行预防和监测,将脱靶效应降至最低。