陈 婷

(福建医科大学附属泉州市第一医院病理科，福建 泉州 362000)

临床研究表明：N-myc下调基因2(NDRG2)属于是一种抑癌候选基因，其表达水平与肿瘤的发生、发展存在紧密的联系[1]。而丝/苏氨酸蛋白激酶2(AKT2)及其磷酸化蛋白(p-AKT2)在多数恶性肿瘤中均呈高表达，但是在肝癌中的应用研究较少[2]。因此，本文采用随机病例选取方法进行研究，探讨NDRG2和AKT2及p-AKT2在肝癌病理组织中的应用及与临床病理的相关性，现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料：选择2016年4月～2018年3月治疗的肝癌患者62例作为对象，男40例，女22例，年龄32～68岁，平均(45.81±5.77)岁；病例类型：肝细胞癌33例，肝管细胞性肝癌24例，混合型肝癌5例。Edmondson分级：Ⅰ级26例，Ⅱ级20例，Ⅲ级16例，Ⅳ级2例。纳入标准：①入组患者均符合肝癌临床诊断标准；②均行手术治疗，术中取病灶标本；③能遵循医嘱完成相关治疗、检查。排除标准：①合并其他恶性肿瘤、精神异常或术前给予放化疗、免疫治疗者；③合并精神异常、妊娠期或哺乳期者。

1.2方法

1.2.1NDRG2、AKT2 mRNA水平：①采用荧光定量PCR技术测定标本NDRG2、AKT2 mRNA水平：分别取病灶组织、癌旁组织，经PBS进行冲洗后加入500 μl trizol吹打，使得组织充分溶解，加入500 μl trizol充分混合、均匀。将上述溶液放入体温5 min下使得蛋白体充分解体，加入0.2 ml氯仿，剧烈震荡15 s，常温下放置2～3 min，15 min离心，速度12 000 rpm，获得三层液体(上层为水相、中间层与下层为有机相)。取RNA沉淀，转移到新的EP管中，加入0.5 ml异丙醇，充分混合后放置在-20℃冰箱中，10 min离心，速度为12 000 rpm，可见凝胶状沉淀(即为RNA)。充分洗涤RNA，并加入250 μl DEPC与750 μl乙醇，利用乙醇完成沉淀的冲洗，5 min离心，速度为7 400 r/min，取沉淀放入工作台上进行20 min干燥。利用紫外分光度仪检测RNA浓度并完成RNA提纯(以Rnase作为空白对照)，在A260下测定吸光度值。采用Dnase酶处理RNA，处理完毕后放入冰箱中，备用。②PCR反应：检测NDRG2、AKT2 mRNA表达量，根据胃癌病灶组织设置相关引物，设定反应条件：30℃，10 min；42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min，连续进行35个循环，最后72℃下完成10 min延长。选择获得的扩增产物，放入1.5%琼脂凝胶进行电泳，完毕后采用UVP凝胶图像完成灰度值的测定，β-actin为内对照[3-4]。

1.2.2NDRG2、AKT2及p-AKT2水平：采用Western Blot法测定标本NDRG2、AKT2及p-AKT2水平。分别制作浓度为6%的积层胶和12%分离胶，每个组织蛋白浓度结果各上样50 μg，转膜2.5 h，电压100 V，完成组织丽春红染色，5%脱脂奶粉下进行1 h封闭，加入一抗，放置在塑料袋中进行15 h孵育，温度4℃，复温到室温，缓慢摇晃1 h，加入三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液5 min，洗膜4次后加入二抗，摇床上振荡，常温下1 h孵育，PBS下5 min冲洗，连续进行4次洗膜。在暗室中利用ELC发光底物硝酸纤维素进行5 min显影，X光底片下进行20 s压片，25 s显影，3 min定影，清水冲洗后晾干，最后利用数码相机对结果进行拍照[5]。

1.3统计分析:采用SPSS18.0软件处理，计数资料行χ2检验，采用率(%)表示，计量资料行t检验，采用均数±标准差表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同组织NDRG2、AKT2 mRNA水平比较:肝癌病灶组织与癌旁组织AKT2 mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05)；肝癌病灶组织中NDRG2 mRNA水平，低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1不同组织NDRG2、AKT2 mRNA水平比较

组织类型例数NDRG2 mRNAAKT2 mRNA病灶组织620.84±0.121.23±0.26癌旁组织621.60±0.211.22±0.27t值8.51713.251P值0.0000.000

2.2两组NDRG2、AKT2及p-AKT2水平比较：肝癌病灶组织中NDRG2蛋白水平，低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)；肝癌病灶组织中AKT2、p-AKT2蛋白水平，高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2两组NDRG2、AKT2及p-AKT2水平比较

组织类型例数NDRG2AKT2p-AKT2病灶组织626.71±0.6714.24±2.4118.50±1.25癌旁组织629.47±1.249.28±0.6812.49±1.08t值10.3955.6819.386P值0.0000.0000.000

3 讨论

NDRG2属于是一种低表达基因，在多种恶性肿瘤或细胞系中表达水平相对较低，但在人中枢神经系统的大脑皮质、白质与神经核中表达水平相对较高，在骨骼干细胞或精细胞中表达水平相对较低，能直接参与细胞的增殖[6]。临床研究表明，NDRG2能抑制恶性肿瘤细胞系，是一种抑癌基因。国内学者研究表明，NDRG2在肝细胞癌组织中表达水平相对较低或不表达，与肿瘤的发生、发展、转归存在紧密的联系。而PI3K-AKT信号转导通路在肝癌的发生、发展中发挥了重要的作用。本研究中，肝癌病灶组织与癌旁组织AKT2 mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05)；肝癌病灶组织中NDRG2 mRNA水平，低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；肝癌病灶组织中NDRG2蛋白水平，低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)；肝癌病灶组织中AKT2、p-AKT2蛋白水平，高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)，说明NDRG2与AKT2、p-AKT2蛋白在肝癌组织中表达异常，均能参与肝癌的发生、发展，能反映疾病的严重程度，与临床病理具有相关性。因此，临床上加强AKT2、p-AKT2、NDRG2测定能评估患者预后，指导临床治疗，利于患者恢复。

综上所述，NDRG2在肝癌组织中呈低表达，而p-AKT2在肝癌组织中呈高表达，二者呈负相关性，均能参与疾病的发生、发展。