丁换云，魏迎凤，陈小飞

(塔里木大学 植物科学学院，新疆阿拉尔 843300)

链格孢属真菌是一类极为常见的真菌，在自然界中分布较广，对生态环境和基质的适应性强，既是重要的植物病原菌又是人和动物的条件致病菌，同时又是非常有应用潜力的生物资源。目前已发现的链格孢菌有近500种，并且每年都有很多新种被陆续报道，只有对其进行正确分类，才能更好地对其进行研究和利用[1]。链格孢属真菌种内形态变异性较大，并且不同生物学性状和不同地理分布的菌株致病力差异也很大[2]。因此，开发出可用于链格孢菌分类鉴定和遗传多样性分析的分子标记，具有十分重要的理论和实践意义。

近年来，已有多种分子标记应用于链格孢菌遗传多样性研究。姚亮亮[3]运用RAPD和AFLP技术研究黑龙江省链格孢属真菌遗传多样性，发现真菌RAPD组群与寄主植物和分离地区之间没有相关性，而AFLP组群与寄主植物之间有一定相关性，但与分离地区之间没有相关性。祖艳青[4]运用ISSR和RAPD标记技术研究河南省烟草赤星病菌及内生链格孢菌的遗传多样性，发现两种标记均能检测出烟草赤星病菌及相关链格孢菌株的遗传多样性。Paul等[5]运用RAPD技术对来自加利福利亚导致番茄坏死的69个A.alternata菌株进行研究，发现可以将菌株划分为两个RAPD组群，且各组群与地理来源没有关联。

A.alternata的近缘种A.tenuissima也是一种对农业生产危害较大的植物病原真菌，常引起多种植物病害[6-8]。黎妍妍等[9]对A.tenuissima等4种链格孢属真菌进行生物学特性研究，发现4种链格孢菌存在着致病性差异。朱海霞等[10]研究A.tenuissima对阔叶杂草的致病性，发现该菌对猪秧秧、藜致病效果突出。然而至今，国内外依然未见有关链格孢菌EST-SSR方面的研究 报道。

本研究运用生物信息学方法，从NCBI数据库中已公布的A.alternataEST序列中筛选SSR，分析其在A.alternata转录组中的分布特点，在此基础上设计A.alternataEST-SSR引物，分析其在近缘种A.tenuissima中的有效性、多态性和通用性，以期为深入开展链格孢菌分类学、比较基因组学以及功能基因组研究提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试菌株：细极链格孢A.tenuissima分离于新疆维吾尔自治区不同地区不同寄主，共38株。其中从梨黑斑病样本分离到5菌株，包括阿拉尔市2株，民丰县1株，尉犁县1株，洛浦县1株；从苹果褐斑病样本中分离到12菌株，其中疏勒县3株，叶城县3株，皮山县2株，阿拉尔2株，阿克陶县2株；从沙枣黑斑病样本分离到13株，其中乌鲁木齐5株，库尔勒3株，民丰县3株，阿拉尔三棵树村1株，第一师五团1株；从杏黑斑病样本上分离到4株，其中阿拉尔3株，策勒县1株；从新和县核桃链格孢叶斑病样本分离到4株。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉15 g，定容至1 L。

试剂及仪器：Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒(真菌)、2×SanTaqPCR Mix、Sterilized ddH2O、DNA Marker D、Ready-to-use、6×loadingbuffer、15% ficoll、Agarose B，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Mastercycler pro梯度PCR仪、荧光和化学发光凝胶成像分析系统，购自美国Bio-Rad公司；DYY-12型电泳仪，购自北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1A.alternataEST-SSR信息分析 从NCBI的EST数据库下载A.alternata的EST序列，运用软件Phred (http://www.phrap.org/consed/consed.html#howToGet)除去长度小于100 bp的序列，运用软件Phrap(http://www.phrap.org/consed/consed.html#howToGet)除去载体序列及重复序列，然后拼接得到较高质量的EST序列，最后运用SSRHunter 1.3软件结合人工查找，对A.alternata的EST序列中的SSR位点进行检测。检测标准为：含二碱基、三碱基、四碱基、五碱基、六碱基，并且重复基元长度大于等于12 bp(二碱基重复次数≥6次、三碱基重复次数≥4次、四碱基重复次数≥3次、五碱基重复次数≥3次、六碱基重复次数≥3次)。对检测出的SSR频率与长度进行统计分析[11]。

1.2.2A.alternataEST-SSR引物设计 采用Primer Premier 5.0 软件，根据EST序列中SSR两端保守序列设计A.alternataEST-SSR引物，所选择的EST-SSR序列两端分别距离5′和3′端应不少于20 bp。引物设计时主要参数为：引物长度18～25 bp，GC含量40%～60%，退火温度(Tm值)为50～65 ℃，PCR扩增长度应为100～500 bp，引物应尽量避免二级结构、发卡结构以及错配的出现。每条引物的评分均高于85分。引物设计好后由生工生物工程(上海)有限公司 合成。

1.2.3A.alternataDNA提取与引物检测 将保存的A.alternata菌种接种至PDA培养基上，置于27 ℃培养箱中培养，待气生菌丝生长至快满皿时，将菌丝刮下置入灭菌的研钵，烘干后备用。采用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒(真菌)提取DNA。

PCR扩增体系为25 μL反应体系，包括2× SanTaqPCR Mix 12.5 μL、Sterilized ddH2O 10 μL、DNA模板0.5 μL、上下游引物各1 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，50～65 ℃(随引物而设置)退火30 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物先用20 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测，有扩增产物的样品采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色法检测产物条带的多态性。

2 结果与分析

2.1 A.alternata EST-SSR的组成及分布特征

2018年12月28日，从NCBI数据库中搜索出A.alternataEST序列共727条，经去冗除杂最后拼接得到298条Unigenes，包括84条Contigs和214条Singletons。运用软件检测出SSR位点共34个，位点数占全部EST序列4.68%，占到Unigenes 11.41%，表明SSR在A.alternata中含量十分丰富。在298条Unigenes中，含有SSR位点的Unigenes 有26条，占全部Unigenes的8.72%；其中只含1个SSR位点的有21条，占80.77%，出现2个SSR位点的有4条，占 15.38%，含5个SSR位点的只有1条，占 3.85%。

在A.alternataEST-SSR中，二、三、四、五、六核苷酸重复基元类型分别为3、7、8、2、2种，分别占总类型的13.64%、31.82%、36.36%、 9.09%、9.09%，核苷酸重复基元类型共有22种，其中四核苷酸基元类型最多，而五、六核苷酸基元类型最少。检测到SSR总数量为34个，其中二、三、四、五、六核苷酸重复基元的SSR数量分别为10、9、11、2、2个，分别占总SSR的29.41%、 26.47%、32.35%、5.88%、5.88%。在所有核苷酸基元类型中，二核苷酸基元类型(GA/TC)n出现频率最高，为2.35%(表1)。

表1 A.alternata EST中重复基元及其比例Table 1 The motifs and their percentages in A.alternata ESTs

2.2 EST-SSR引物通用性检测

根据拼接整理好的298条Unigenes序列，共设计13对EST-SSR引物(表2)，然后对来自新疆不同地区不同寄主的38个A.tenuissima进行PCR扩增。结果表明除4对引物(con36、con59、con66、sin18)未产生扩增产物外，其他9对引物均扩增出与预期片段大小一致的条带，有效扩增效率为69.23%。而在9对引物中除4对引物(con14、sin34、sin104、sin168)只能扩增出单一条带，其余5对(con78、con80、sin94、sin109、sin153)均能扩增出多态性条带(图1，图2)，扩增多态率为55.56%，说明这5对引物在近缘种中具有通用性。

表2 设计合成的13对EST-SSR引物Table 2 Thirteen pairs of EST-SSR primers were designed and synthesized

1-2.LALAR; 3.LMF; 4.LWL; 5.LLPX; 6-8.PSLX; 9-11.PYCX; 12-13.PPS; 14-15.PALAR; 16-17.PAKT; M.Maker; 19-23.SWLMQ; 24-26.SKRL; 27-29.SMF;30.SSKS; 31.SWT; 32-34.HXH; 35-37.XALAR; 38.XCL

图1 引物con78在38个细极链格孢菌中的扩增结果
Fig.1 Amplification result of 38A.tenuissimaEST-SSR markers by primers of con78

1-2.LALAR; 3.LMF; 4.LWL; 5.LLPX; 6-8.PSLX; 9-11.PYCX; 12-13.PPS; 14-15.PALAR; 16-17.PAKT; M.Maker; 19-23.SWLMQ; 24-26.SKRL; 27-29.SMF;30.SSKS; 31.SWT; 32-34.HXH; 35-37.XALAR; 38.XCL

图2 引物sin94在38个细极链格孢菌中的扩增结果
Fig.2 Amplification result of 38A.tenuissimaEST-SSR markers by primers of sin94

3 结论与讨论

本研究对727条A.alternataEST进行筛选除冗和拼接，得到298个片段，共发掘出34个SSR位点，平均5.343 kb含有1个SSR位点。而在其他真菌中，香菇的EST序列平均每 25.942 kb含有1个SSR位点[12]，大豆疫霉菌的EST序列平均每8.9 kb含有1个SSR位点[13]，这表明交链格孢菌中SSR出现频率较高，SSR含量丰富。本研究共检测出22种重复基元类型，其中出现频率最高的是(GA/TC)n基元类型，以四核苷酸基元种类最多，而五、六核苷酸基元种类 较少。

随着植物病原菌基因组研究的发展，很多植物病原菌的EST已被开发，从EST数据库中挖掘SSR分子标记，为植物病原菌SSR标记的发展提供了一条便利途径。SSR一般含有2～5个等位位点，在植物病原菌研究中不仅用于种群遗传多样性、近缘种的比较及系谱研究[14-15],而且还可以用于不同寄主分离物之间的比较[16-17]。在种内检测多态性水平上，EST-SSR标记检测水平要低于其他一些从非编码区分离的标记，然而EST-SSR标记检测的是基因组表达部分的变异，是真正与性状连锁的标记，这将可能对决定重要表型性状的等位基因进行直接鉴定。另外，EST-SSR分子标记一般具有很好的通用性，一旦开发便可以在近缘种(属)中进行应用[18]。一般情况下，同属不同种植物间EST-SSR引物扩增成功率为50%～100%[19]。不同种真菌间的扩增成功率为 34%[20]。Kumar等[21]研究发现70%的尖镰孢菌EST-SSR引物能在潮湿镰孢菌中通用；Dracatos等[22]研究黑麦冠锈菌EST-SSR引物对6种真菌的通用性，发现扩增的成功率达到 22%～53%。由于真菌EST数据库资源有限，很多学者便以真菌近缘种的EST数据资源，开发可用于真菌本身分类鉴定与遗传多样性的分子标记。如许韬等[23]从大麦白粉菌EST数据库开发小麦白粉菌的SSR分子标记，效果比较理想。李新凤等[24]开发尖镰孢菌EST-SSR分子标记，并在近缘镰孢菌种中进行通用性检测，结果表明基于尖镰孢EST序列开发镰孢菌通用SSR标记是可行的。

本研究利用A.alternataEST数据库，开发设计13对SSR引物中，通用性检测表明共有9对引物能够在A.tenuissima种内有效扩增，而具有多态性引物就有5对，这表明在不同A.tenuissima菌株间存在着遗传分化，同时也说明基于A.alternata开发的EST-SSR引物，完全适用于研究A.tenuissima的遗传多样性。因此A.alternataEST-SSR分子标记的开发，为该菌近缘种A.tenuissima的鉴别、遗传变异等研究提供重要的标记资源，为进一步研究A.tenuissima的群体遗传学、分子生物学、分子流行学打下坚实 基础。