李 杰，孟庆玲，乔 军，伍晔晖，王熙凤，王立霞，才学鹏

(1.石河子大学 动物科技学院，新疆石河子 832003；2.中国农业科学院 兰州兽医研究所，兰州 730046)

单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)是一种重要的食源性人兽共患病原菌，人类通过食用被LM污染的食物发生感染，引起孕妇流产，幼儿或免疫能力低下者感染脑膜炎，胃肠炎等严重疾病[1-2]。LM具有强大的环境适应能力，能耐受高温、酸、碱、渗透压、乙醇和氧化应激等各种胁迫环境[3]。

生物被膜(Biofilm,BF)是细菌通过分泌的多糖、蛋白质等代谢产物粘附于生物或非生物表面形成的膜样结构[4-5]。现有的研究发现，BF可增强细菌的耐药性和环境应激抵抗能力，从而影响细菌的毒力[6]。现有的研究发现，agr群体感应系统参与LM BF的调控[7]，agr基因座由4个基因组成，其中agrB负责膜蛋白的表达，它与Sps共同作用可将agrD表达的肽段转化为成熟的自诱导肽(AIP)；agrC和agrA形成一个转导信号的双组分系统，当细胞外AIP浓度达到一定阈值时，通过群体感应激活agrC-agrA系统，被激活的系统调节BF形成相关基因的表达[8-10]。有研究证实，agr位点基因突变降低了LM粘附于非生物表面形成BF的能力[11-12]，BF阴性菌株agr基因座表达水平显著低于BF阳性菌株[10]。

细菌BF形成与其AraC家族转录调控因子密切相关。AraC家族转录调控因子在许多菌中已被报道参与细菌BF的形成[13-14]，然而在LM菌中尚未见报道。因此，本研究利用同源重组技术构建LM-△lmo2672缺失株，分析比较LM EGD-e亲本株和LM-△lmo2672缺失株在不同温度、渗透压、胆酸盐、H2O2等环境中BF生成量的差异，利用qRT-PCR检测BF相关基因(agrA，agrB，agrC，agrD)的转录水平，探讨lmo2672基因在LM BF形成中的作用，为进一步了解LM AraC家族在调控BF的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

LM EGD-e菌株由德国伍兹堡大学W.Goebel教授惠赠；pKSV7由石河子大学动物科技学院微生物实验室保存；pMD19-T载体，T4连接酶，限制性酶切酶KpnⅠ，PstⅠ，DL 5000 DNA marker，DL 2000 DNA marker购自TaKaRa公司；基因组DNA提取试剂盒，胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒购自TIANGEN生化技术有限公司；氯霉素，胆汁酸盐购自Sigma公司；BHI培养基青岛海博生物科技有限公司，氯化钠购自天津盛奥生物试剂公司。

1.2 引 物

根据NCBI中LM EGD-e的基因序列(登录号：AL591824.1)，利用Primer 5.0软件设计LM缺失株构建过程中所涉及的引物及BF相关基因的qRT-PCR引物，其中R1和R4 5′端分别添加KpnⅠ、PstⅠ酶切位点及保护性碱基(斜体下划线部分)(表1)。

表1 本研究中所用引物Table 1 List of primer sequences used in this study

1.3 LM-△ lmo2672缺失株的构建

1.3.1 重组穿梭质粒pKSV7-△lmo2672的构建 按照细菌基因组DNA提取试剂盒步骤提取LM EGD-e菌株的基因组DNA，用R1/R2和R3/R4两对引物分别扩增出目的片段的上、下游同源臂。以上、下游同源臂为模板，通过SOE-PCR技术融合上下游同源臂，获得缺失目的基因的融合片段，将融合片段和pKSV7同时提质粒，经KpnⅠ和PstⅠ双酶切后用T4连接酶过夜连接，构建重组穿梭质粒pKSV7-△lmo2672。

1.3.2 LM-△lmo2672缺失株的构建与鉴定 将pKSV7-△lmo2672在2.5 kV，5.0 ms条件下电转至LM感受态中，用R1/R4引物鉴定阳性克隆，并将阳性菌在氯霉素和42 ℃双重抗性下连续传代进行同源重组，用旁外侧引物R5/R6引物检测确定获得缺失株；将缺失株在无氯霉素抗性， 37 ℃继续培养20代并检测其遗传稳定性。

1.4 lmo2672基因缺失对LM在不同环境中BF形成能力的影响

利用微孔板法制备BF。将过夜培养的LM EGD-e和LM-△lmo2672分别离心收集菌体，用新鲜的BHI培养基调整OD600至0.2，分别吸取200 μL菌液加入96孔微孔板，放置于不同温度(4 ℃，30 ℃和37 ℃)；用含5% NaCl、8% NaCl、0.3%胆酸盐、5 mmol/L H2O2的BHI培养基调整OD600至0.2，放置于37 ℃培养到指定时间后，弃去培养基并用无菌水洗涤微孔板3次，充分洗净孔内浮游菌体，室温干燥以去除微孔板中液体；加入结晶紫染色，用酶标仪测定OD570nm以代表BF生成量。每个样品设置5个重复。

1.5 lmo2672缺失对LM BF相关基因转录水平的影响

参考Rieu等[11]设计的BF相关基因qRT-PCR引物。将待测菌液用新鲜的BHI培养基接种于六孔板中，分别放置于4 ℃，30 ℃；或用含5% NaCl、8% NaCl、0.3%胆酸盐、5 mmol/L H2O2的BHI培养基接种于六孔板中，在37 ℃培养24 h，收集BF状态下的细菌进行总RNA提取，并根据反转录试剂盒反转录为cDNA，利用NanoDrop 2000分光光度计测定cDNA质量浓度，以统一质量浓度的cDNA为模板，以管家基因rpoB和16S rRNA作为内参，在LightCycler 480仪器上进行qRT-PCR，结果根据2-△△CT的方法计算4对BF相关基因(agrA，agrB，agrC，agrD)的相对转录水平。

1.6 数据统计

所有试验均重复3次，采用GraphPad Prism 5.0进行组间差异显著性分析，数据采用“平均值±标准误”表示。P<0.05(*)被认为差异显著，P<0.01(**)被认为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 重组穿梭质粒pKSV7-△ lmo2672构建及鉴定

分别扩增目的基因上、下游同源臂，可扩增出638 bp和698 bp的条带，经SOE-PCR后，得到 1 336 bp的融合片段，条带大小与预期结果相符(图1)；将融合片段与pKSV7载体连接，双酶切后条带大小与理论相符，表明已成功构建重组穿梭质粒pKSV7-△lmo2672(图2)。

M.DNA maker(DL2000);1-3.上下游臂融合片段 Fusion segments of upstream and downstream regions; 4.阴性对照 Negative control

图1lmo2672基因上下游臂SOE-PCR扩增
Fig.1 Amplification oflmo2672gene by SOE-PCR

M.DNA maker(DL2000 Plus); 1.pKSV7-Δlmo2672双酶切产物 Products of the pKSV7-Δlmo2672by double enzyme digestion; 2.pKSV7-△lmo2672质粒 Recombinant plasmid pKSV7-Δlmo2672; 3.pKSV7空质粒 Empty plasmid pKSV7

图2 pKSV7-△lmo2672双酶切鉴定
Fig.2 Identification of pKSV7-△lmo2672by double enzyme

2.2 LM-△ lmo2672缺失株的筛选及遗传稳定性的鉴定

利用R5/R6引物筛选能扩增出大小为 1 502 bp条带的重组菌株，获得LM-△lmo2672缺失株(图3)；在37 ℃、无氯霉素抗性的培养基中继续传20代，R5/R6引物检测均可扩增出 1 502 bp单一片段(图4)，表明LM-△lmo2672具有良好的遗传稳定性。

M.DNA maker(DL2000); 1.阳性对照 Positive control； 2-4.LM-△lmo2672重组菌旁外侧引物检测结果 PCR products of the recombinant LM-△lmo2672; 5.阴性对照 Negative control

图3 旁外侧引物对LM-△lmo2672重组菌的鉴定
Fig.3 Identification of LM-△lmo2672by PCR

2.3 lmo2672缺失对LM在不同环境中BF生成能力的影响

在37 ℃时，两株菌所形成的BF没有显著差异(P>0.05)；但在4 ℃和30 ℃，LM-△lmo2672BF生成量均显著低于LM EGD-e(P<0.05)(图5-A)；在5%和8% NaCl中，与LM EGD-e相比，LM-△lmo2672BF生成量显著减少(P<0.05)(图5-B)；在5 mmol/L H2O2和 0.3%胆酸盐中，LM-△lmo2672BF生成量减少，显著低于LM EGD-e(P<0.05)(图5-C)，表明lmo2672缺失能降低LM在不同环境中BF的形成量。

M.DNA maker(DL2000);1-2.阳性对照 Positive control;3.阴性对照 Negative control

图4 LM-△lmo2672缺失株遗传稳定性鉴定
Fig.4 Genetic stability analysis of recombinantstrain of LM-△lmo2672

2.4 lmo2672缺失对LM在不同阶段BF形成能力的影响

在培养24 h时，LM-△lmo2672所形成的BF交联程度弱于LM EGD-e，但差异不显著(P>0.05)；在48 h时，LM-△lmo2672生物被膜着色厚度以及形成量极显著低于LM EGD-e(P<0.01)(图6)，表明lmo2672基因参与LM BF的形成。

2.5 lmo2672缺失对LM BF相关基因转录水平的影响

在4 ℃和30 ℃，LM-△lmo2672中4个与BF形成相关基因的表达量均显著低于LM EGD-e(P<0.05)(图7-A、图7-B)；在高渗透压环境中，LM-△lmo2672agrA和agrB基因表达量显著低于LM EGD-e(P<0.05)(图7-C、图7-D)，且随着渗透压的升高，LM-△lmo2672BF相关基因的表达量发生降低；在氧化环境中，agrC基因表达量显著低于LM EGD-e(P<0.05)(图7-E)；在胆酸盐环境中，LM-△lmo2672BF形成相关基因的表达量均极显著低于LM EGD-e(P<0.01)(图7-F)，表明lmo2672缺失后BF形成相关基因的表达受到抑制。

图5 LM EGD-e和LM-△ lmo2672在不同胁迫环境中的BF形成Fig.5 Biofilm formation by LM EGD-e and LM-△ lmo2672 under various conditions

3 讨 论

LM是一种重要的食源性致病菌，由于其对各种环境压力的强耐受性和BF形成的能力使其在加工设备表面上残留并形成BF，因此在动物源性食品生产和加工中极易被污染[15-16]，给动物性食品安全造成较大威胁[17-18]。现有研究认为，AraC家族转录调控因子介导细菌BF相关基因的转录调控[13-14]，在许多细菌BF形成过程中发挥重要的调控，然而关于LM中AraC家族转录调控因子lmo2672是否影响LM BF形成目前尚不清楚。

细菌BF的形成一般分为初始粘附、不可逆粘附、微菌落形成、成熟、播散期5个阶段[19]。在非生物表面孵化的24 h之前是细菌形成BF粘附的重要时期，在48 h后被认为是BF形成的成熟期[10,20]。本研究发现，在37 ℃培养24 h时，LM-△lmo2672缺失株与LM EGD-e 亲本株BF形成量差异不显著；但在48 h时LM-△lmo2672生物被膜生成量以及BF着色程度显著低于LM EGD-e，提示lmo2672可能在BF成熟期中发挥作用。

A.在24 h，48 h时LM BF OD570的测定 Biofilm of LM biofilm determined by OD570at 24 h and 48 h,respectively;B.在24 h，48 h时LM显微镜下BF结构 Formation of biofilm by LM at 24 h and 48 h,respectively.

图6lmo2672基因缺失对LM在不同时间BF形成的影响
Fig.6 Effects oflmo2672gene deletion at different times on biofilm formation of LM

A-F.分别为4 ℃，30 ℃，5% NaCl，8% NaCl，5 mmol/L H2O2和0.3%胆酸盐中BF相关基因转录水平检测 Relative transcriptional levels of genes related to biofilm formation at 4 ℃,30 ℃,5% NaCl,8% NaCl,5 mmol/L H2O2and 0.3% bile salts,respectively

图7 LM EGD-e和LM-△lmo2672在不同应激环境中BF相关基因相对转录水平的检测
Fig.7 Relative transcriptional levels of genes related to biofilm formation under differentenvironmental stresses in LM EGD-e and LM-△lmo2672

BF形成受多种因素的影响，其中温度对BF的形成影响较大[17,21]。Di Bonaventura等[17]分析44株LM分离株在不同温度下BF形成情况，发现随着温度降低，LM形成的BF组织结构越稀疏；Chavant等[22]研究表明，LM在37 ℃时对聚四氟乙烯表面有定植能力，但在8 ℃时则没有。本研究证实，在37 ℃更有利于LM形成BF，而在4 ℃和30 ℃时，LM-△lmo2672生物被膜生成量显著低于LM EGD-e。qRT-PCR结果证实，随着温度的降低，LM-△lmo2672生物被膜相关基因的表达量逐渐下降，在4 ℃和37 ℃ 4个基因的表达量均显著低于LM EGD-e，表明lmo2672基因缺失后导致LM在低温下BF的形成能力降低，且BF相关基因的表达也受到抑制。

已有研究表明，AraC调控因子通过调控相关基因的表达影响表皮葡萄球菌、粪肠球菌等BF的形成[23-24]。本研究利用结晶紫染色法制备BF，比较LM EGD-e和LM-△lmo2672在高渗透压、胆酸盐、H2O2环境中BF生成量的差异，证实LM-△lmo2672BF形成量在不同应激环境下均显著降低，进一步qRT-PCR发现，lmo2672基因缺失后，LM-△lmo2672agr系统基因表达量也出现降低，其中在胆汁酸盐环境中4个BF相关基因的表达量显著降低，在渗透压中，agrA和agrB基因表达量显著降低，在氧化环境中，agrC基因表达量显著降低，提示lmo2672基因可能通过调控agr系统中相关基因的表达来降低LM BF的形成能力。

总之，本研究证实LM-△lmo2672缺失株在不同环境中BF形成量显著降低，且BF相关基因的表达受到抑制，表明AraC家族转录调控蛋白lmo2672在LM BF形成过程中发挥重要作用，为揭示AraC家族调控因子在LM BF形成能力中的作用提供理论依据。