陈建安，陈丽莉，丁 茜，周 静，何永明，吴伯艳，朱学海

(中山大学附属东华医院检验科，广东东莞 523110)

不明原因反复自然流产(URSA)指除解剖因素、遗传疾病、内分泌疾病及感染等因素致胎儿非正常发展，连续2次或多次怀孕时，在同一妊娠周期发生自然流产的现象，仍有60%～70%反复性流产患者由不明病因所致，对女性的生殖和心理健康有严重的伤害。目前的研究多认为，与母胎界面免疫调节失调导致URSA患者的免疫耐受失衡有关[1]，正常妊娠时，Th1/Th2平衡起着非常重要的作用，而Th1/Th2失衡时对流产的发生也有重要作用[2]。Th1/Th2平衡可影响细胞免疫与体液免疫的平衡，免疫调节细胞亦可影响Th1/Th2平衡。NKT细胞是一种免疫调节性淋巴细胞，而淋巴细胞亚群分析能很好地反映细胞和体液免疫功能，本研究旨在研究URSA患者外周血CD3+CD56+CD16+NKT细胞和T淋巴细胞亚群的表达情况，为了解URSA患者的细胞免疫功能状态提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年11月至2018年10月来中山大学附属东华医院妇科门诊或生殖中心就诊的URSA患者53例为研究对象，年龄21～43岁，具有3次或3次以上自然流产史，排除解剖因素、遗传疾病、内分泌疾病及感染等因素的女性患者。健康对照组22例为体检健康妇女，年龄18～36岁。分别抽取URSA患者和健康对照组妇女静脉全血2 mL，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管内,混匀后送检，常温保存，48 h内上机检测。

1.2仪器与试剂 仪器为美国Beckman-coulter公司生产的FC500MCL流式细胞仪，试剂为广东国药有限公司提供的Beckman-coulter公司生产的CD45-异硫氰酸荧光素(FITC))/CD8-藻红蛋白(PE)/CD4-藻红蛋白-德克萨斯红(ECD)/CD3-藻红蛋白-花青素(PC5)；CD45-FITC/CD56+16-PE/CD19-ECD/CD3-PC5等荧光抗体试剂，磷酸盐缓冲溶液(PBS)，红细胞裂解液。

1.3检测方法 分别加入CD45-FITC/CD8-PE/CD4-ECD/CD3-PC5，CD45-FITC/CD56-PE/CD19-ECD/CD3-PC5试剂各5 μL至2管流式专用管内底端，同时分别加入50 μL抗凝全血避光反应20 min，加入红细胞裂解液 500 μL，避光 20 min 后加入 PBS 上机检测，用CD45/SS设门圈定淋巴细胞群。在十字门图中分别分析CD3+区域细胞百分比，即为CD3+T细胞；CD3+且CD4+区域细胞的百分比，即为CD3+CD4+Th细胞表达率；在CD3+而CD8+性区域的百分比，即为CD3+CD8+Tc细胞表达率；在CD3-而CD19+性区域的百分比，即为B细胞表达率; 在CD3-而CD56+CD16+性区域的百分比，即为NK细胞表达率; 在CD3+而CD16+56+性区域的百分比，即为NKT细胞表达率。

2 结 果

2.1CD3-CD56+CD16+NK细胞、CD3+CD56+CD16+NKT细胞在URSA患者外周血的表达情况 CD3+CD56+CD16+NKT细胞在URSA患者组外周血表达率明显高于健康对照组(t=2.924,P<0.01)，而 CD3-CD56+CD16+NK细胞和B淋巴细胞在URSA患者外周血表达与健康对照组比较，差异无统计学意义(t=0.773、-0.162，均P>0.05)。见表1。

表1 CD3-CD56+CD16+ NK细胞、CD3+CD56+CD16+ NKT细胞在URSA患者和健康对照组外周血的表达率比较

2.2T淋巴细胞亚群在URSA患者外周血的表达情况 CD3+T细胞、CD3+CD4+Th细胞、CD3+CD8+Tc细胞在URSA患者外周血表达率与健康对照组比较,差异无统计学意义(t=0.591、0.007、0.354,均P>0.05)，Th/Tc比值在URSA患者较健康对照组偏高，差异有统计学意义(t=2.045,P<0.05)。见表2。

表2 CD3+ T细胞、CD3+CD4+ Th细胞、CD3+CD8+ Tc细胞等在URSA患者和健康对照组外周血的表达率比较

图1 NKT细胞与Th/Tc的直线回归关系散点图

图2 NKT细胞与B细胞直线回归关系散点图

2.3URSA患者CD3+CD56+CD16+NKT细胞与Th/Tc、B细胞的关系 CD3+CD56+CD16+NKT细胞与Th/Tc比值的相关系数为0.004 8，CD3+CD56+CD16+NKT细胞与B细胞相关系数为0.000 4，均无正相关关系(P>0.05)。见图1、2。

3 讨 论

CD3+CD56+CD16+NKT细胞是一种新鉴定的免疫调节性细胞，是一种特殊类型的T淋巴细胞，其细胞表面不仅有T细胞受体，也有NK细胞的受体[3]；NKT 细胞的表面标志物表达为CD3+CD56+CD16+，其生物学作用主要包括免疫调节和细胞毒作用。有研究认为NKT细胞被激活后分泌大量的细胞因子，包括白细胞介素(IL)-4、IL-10、IL-13，及干扰素等，通过影响Th1/Th2 平衡，从而发挥免疫调节的作用[4]。

有研究认为NKT细胞与母胎界面有非常密切的关系,DANG等[5]研究显示孕鼠的子宫中在围着床期检测到大量的NKT细胞，并且推测NKT细胞可能分泌IL-4，诱导Th2型微环境偏移，从而在围着床期发挥重要的作用；且NKT细胞在诱导流产过程中可能有重要的作用。ITO等[6]研究显示，Va14 NKT/VB7细胞与生殖免疫有一定的相关性，提出a-GaIcer以Va14 NKT细胞依赖方式引起小鼠流产。袁静等[7]研究显示，少量的CD3+CD56+CD16+NKT样细胞对维持妊娠有一定的作用，其可分泌大量的细胞因子，参与机体的免疫反应，其数量的增多与妊娠结局呈负相关，当外周血中CD3+CD56+CD16+NKT细胞表达率增高时，发生流产的概率随之升高[8]。本研究显示，CD3+CD56+CD16+NKT细胞在URSA患者外周血表达率明显高于健康对照组，与袁静等[7]、蒋楠等[9]的报道相类似，提示外周血NKT细胞的增多对反复自然流产有一定的作用，可能影响Th1/Th2平衡，其偏移向Th1型时，增强细胞免疫功能，在母胎界面的免疫排斥反应亦增强，抑制免疫耐受而导致流产的发生；但与陈卫光等[10]、LIN等[11]的报道的不同，其NKT细胞较健康对照组偏低。已有报道证实，当Th1型细胞因子分泌时，活化蜕膜上的NK细胞[12]，NK细胞是一种具有细胞毒性的杀伤细胞，可激活下游一系列细胞和因子的级联反应，放大免疫杀伤作用，因子的平衡对妊娠是否成功起重要作用[13]。

T淋巴细胞亚群主要包括辅助性T淋巴细胞(Th细胞，表型表现为CD3+CD4+)、杀伤性T淋巴细胞(Tc细胞，表型表现为CD3+CD8+Tc)，其是重要的免疫功能状态的检测指标，当Th/Tc升高时，提示细胞免疫功能亢进，下降提示细胞免疫功能下降。本研究显示CD3+T细胞、CD3+CD4+Th细胞、CD3+CD8+Tc细胞在URSA患者外周血表达率与健康对照组比较，差异均无统计学意义，与司斯[14]的报道有所不同，而Th/Tc比值在URSA患者偏高，提示其细胞免疫功能亢进，可能与反复自然流产的发生有一定关系[15]。本研究显示URSA患者外周血CD3+CD56+CD16+NKT细胞表达率与Th/Tc比值、B细胞表达率均无正相关关系，提示造成URSA患者细胞免疫功能增强而引起流产，CD3+CD56+CD16+NKT细胞与Th/Tc表达的增高无必然关系，其可能均是一种反映URSA患者细胞免疫功能状态的独立指标因素,因此，同时检测此两项指标更能提示URSA患者细胞免疫功能状态。

综上所述，CD3+CD56+CD16+NKT细胞、Th/Tc比值在URSA患者外周血表达水平与反复自然流产的发生有一定的关系，通过检测CD3+CD56+CD16+NKT细胞和Th/Tc比值对评估USRA患者的免疫功能状态和临床对患者免疫功能的有效干预有重要意义。