谢 敏，周建华，朱国琴，张 瑜

(1.电子科技大学医学院附属妇女儿童医院·成都市妇女儿童中心医院小儿肾脏科，四川成都 611731；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院小儿肾脏科，湖北武汉 430060；3.无锡市儿童医院儿童肾脏科，江苏无锡 214000)

肾间质纤维化是慢性肾脏疾病(CKD)发展为终末期肾脏病(ESRD)的最后通路[1]，其发病机制非常复杂，与蛋白激酶通路的激活、氧化应激、炎性反应等多因素相互作用相关。既往研究证实，肾小管周围血管内皮结构的损伤和改变可以导致肾脏滤过功能下降最终发展为肾间质纤维化[2]。血管内皮生长因子(VEGF)由肾小管上皮细胞分泌，具有营养、活化、促进血管生成的功能，对于维持肾小管周毛细血管正常结构与功能有着重要作用，推测VEGF可能与肾间质纤维化有较为密切的关系[3]。本研究以单侧输尿管梗阻大鼠为实验模型，观察不同时间点肾组织VEGF的表达情况，分析其与肾功能、24 h尿蛋白、肾间质纤维化程度的相关性，探究其在肾间质纤维化发生发展中所起的作用，进而为肾脏疾病早期药物治疗的研究提供实验依据 。

1 材料与方法

1.1实验动物与模型制作 普通级SD雄性成年大鼠42只，体质量160～200 g，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。运用随机方法分为假手术组和单侧输尿管梗阻模型组(UUO组)，每组21只大鼠。动物模型制备：大鼠以10%水合氯醛300 mg/kg,腹腔注射，行左侧腹部切口，逐层分离暴露左侧输尿管，用0#丝线上下结扎2处，上一处结扎点位于左肾下极水平，然后于结扎点间剪断输尿管，缝合肌肉、皮肤层制备大鼠单侧输尿管梗阻模型。假手术组大鼠开腹后不结扎输尿管，直接缝合腹腔，作为对照[4]。2组分别于手术后第5、15、25天处死大鼠，每个时间点处死7只，留取肾组织常规石蜡包埋切片，经HE+Masson染色证实大鼠单侧输尿管梗阻造模成功。

1.2主要试剂 兔抗大鼠VEGF多克隆抗体(美国Peprotech公司)，生物素化山羊抗兔IgG(美国Peprotech公司),SABC试剂盒(美国Peprotech公司)，H2O2-氨基联苯胺(美国Peprotech公司)。

1.3免疫组织化学染色 采用链霉素亲和素-生物素复合物(SABC)技术检测VEGF的表达，操作步骤按说明书进行。

1.4实验结果分析方法

1.4.124 h尿液标本采集 各组大鼠分别于第5、15和25天处死,每次7只。处死前将各组大鼠放入代谢笼中收集24 h尿液，尿蛋白测定使用尿蛋白双缩脲试剂盒完成。

1.4.2肾功能检测 血肌酐及尿素氮检测按血肌酐检测试剂盒及血尿素氮检测试剂盒操作步骤完成。

1.4.3肾脏组织病理学 将组织切片进行HE、Masson染色，在光学显微镜下进行肾间质纤维化程度半定量评分，采取双盲法，取各组平均值。每张切片至少观察40个皮质区200倍视野，测定间质纤维化面积占同视野小管间质总面积的百分比，积分如下：0分为正常无病变；1分为肾小管上皮细胞轻度萎缩、变性，病变范围<15%；2分为肾小管上皮细胞中度萎缩，纤维组织少量增生，病变范围15%～25%；3分为肾小管变性、坏死轻，纤维组织中度增生，病变范围26%～50%；4分为肾小管变性、坏死中度，纤维组织多灶状增生，病变范围51%～75%；5分为肾小管上皮细胞萎缩，成片坏死，纤维组织增生呈片状，病变范围>75%[5-6]。

1.4.4VEGF表达半定量评分 肾脏皮质观察40个连续不重叠的200倍视野，细胞胞质呈现棕黄色颗粒为阳性信号,光镜下观察阳性染色的分布，分为0～3分：0分为无染色，1分为局部染色，2分为轻度至中度弥散染色，3分为重度弥散染色。计算 20个肾皮质高倍视野(×200)分值、求和、取均值，3人盲法同时进行，取平均值，得VEGF表达分值[7]。

2 结 果

2.12组大鼠24 h尿蛋白定量及大鼠肾功能改变 UUO组术后第5、15天，血肌酐和尿素氮均升高，提示肾功能损伤，且明显高于同期假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)。但术后第25天增高的尿素氮值较前下降，分析可能与健侧肾脏代偿有关。术后第5天，UUO组与假手术组比较，24 h尿蛋白定量差异无统计学意义(P>0.05)，术后第15、25天，UUO组24 h尿蛋白逐渐升高，均高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组大鼠血尿素氮、血肌酐、24 h尿蛋白定量检测结果

注：与假手术组比较，aP<0.01，bP<0.05。

2.2肾小管间质病理改变 假手术组各期肾小管形态正常，无明显萎缩，肾间质无炎症细胞浸润。UUO组，术后第5天，肾间质小灶状炎症细胞浸润，部分肾小管管腔扩张；术后第15天，肾小管间质见较多炎症细胞浸润，较多肾小管管腔扩张，少数肾小管萎缩，肾间质开始出现纤维化改变；术后第25天，肾间质大片炎症细胞浸润，肾小管片状萎缩，肾间质明显纤维化。见图1、2。

注：A表示假手术组第5天；B表示假手术组第15天；C表示假手术组第25天；D表达UUO组第5天；E表示UUO组第15天；F表示UUO组第25天。

图1 2组肾小管间质纤维化病理图

注：与假手术组相比，aP<0.01 。

图2 2组肾小管间质纤维化评分

2.3VEGF的表达水平 假手术组：各时期几乎所有肾小管均表达VEGF。UUO组：术后第5天，可见部分肾小管基底膜有VEGF表达，其表达量低于假手术组；术后第15天，VEGF表达量明显下降，肾间质炎症细胞浸润及肾小管扩张明显区域，可见少许VEGF表达；术后第25天，VEGF表达持续降低，部分肾小管萎缩区域呈弱阳性表达，肾间质纤维化严重的区域VEGF无表达。UUO组在第5、15、25天VEGF的表达量均低于同期假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、4。

注：A表示术后第25天假手术组VEGF广泛表达于所有肾小管；B表示术后第25天UUO组肾小管萎缩处VEGF弱表达。

图3术后第25天VEGF表达(免疫组织化学×200)

注：与假手术组相比，aP<0.01。

图4各组VEGF表达评分

2.4UUO组VEGF在肾小管间质的表达与24 h蛋白尿定量、血肌酐及尿素氮的关系 在第5天时，VEGF的表达和24 h尿蛋白定量呈正相关(P<0.05)，第15、25天VEGF的表达和24 h尿蛋白定量无明显相关性(P>0.05)；各个时间点VEGF的表达与血肌酐及尿素氮的水平无明显相关性(P>0.05)。见表2。

表2 UUO组中VEGF与24 h蛋白尿定量、血肌酐及尿素氮的相关系数

注：表示相关性，aP<0.05。

3 讨 论

肾间质纤维化是各种CKD进展到终末期的共同途径，严重危害人类健康。因此，关于肾间质纤维化的研究逐渐成为慢性病的研究热点。肾间质纤维化的机制较为复杂，炎症细胞浸润致肾小管上皮细胞激活，释放细胞因子，刷状缘损伤、凋亡或坏死的肾小管上皮细胞堵塞小管导致肾功能下降[8-9]。除此之外，肾小管周毛细血管内皮细胞损伤，肾间质缺血缺氧诱导成纤维细胞转分化，最终导致肾小管间质纤维化的发生[10]。VEGF是一种具有亲肝素活性的糖基化分泌性多肽因子，可以促进血管内皮细胞增殖，增强血管通透性，有利于新生血管的生成[11]。有研究证实，VEGF可以使肾小管内皮依赖性血管扩张，帮助维持肾小管完整性，在急性肾损伤治疗领域发挥重要作用[12]。有实验发现通过抑制血管紧张素Ⅱ调节VEGF的表达抑制肾小球毛细血管功能的完整性可以保护肾脏功能[13]。

单侧输尿管梗阻模型通过结扎单侧输尿管致梗阻性肾病，是研究肾间质纤维化的经典模型，有文献报道，单侧输尿管梗阻模型建立的成功率高于常规背侧入腹行输尿管上段结扎的术式，且明显地降低了肾积脓的发生率[14]。本研究通过制作单侧输尿管梗阻大鼠模型，经HE和Masson染色，观察到随梗阻时间延长，UUO组大鼠肾小管间质弥散性炎性细胞浸润，肾小管萎缩，肾间质大面积纤维化，证明单侧输尿管梗阻模型造模成功。在本实验中通过测定不同时间点肾小管间质VEGF的表达水平，探讨其与肾小管间质纤维化的关系。实验结果发现UUO组术后第5天VEGF表达量开始下降，与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05)，第15天VEGR表达量进行性下降，仅在少许的肾小管上皮细胞中有表达。第25天VEGR表达量显著下降，肾间质纤维化严重的区域几乎无表达。实验证实UUO组随着梗阻时间延长，肾小管间质缺血缺氧加重，大量的炎性细胞浸润到肾间质，进一步加重了肾脏的纤维化程度。本研究发现VEGF的表达量与肾功能无明显相关性，可能与健侧肾功能代偿有关，在第5天时，VEGF的表达与24 h尿蛋白定量呈正相关(P<0．05)，第15、25天VEGF的表达和24 h尿蛋白定量无明显相关性(P>0.05)。实验结果证实VEGF表达与肾间质纤维化病变活动相关，早期监测VEGF在肾间质中的表达可以判断肾间质纤维化活动性病变。

4 结 论

VEGF与肾间质纤维化进展密切相关，其在调节细胞外基质合成与分解及调控肾小管周毛细血管生长中起关键作用[15]。研究VEGF参与早期肾间质纤维化毛细血管新生的机理，有助于对肾间质纤维化机制的进一步认识，为抑制肾纤维化的进展，改善肾功能提供理论依据[16]。通过监测肾间质纤维化过程中VEGF的表达，实现对肾间质纤维化的早期干预有待笔者进一步研究。