刘艳红，谢东平，董小瑜

(武汉大学人民医院检验科，湖北武汉 430060)

活化部分凝血活酶时间(APTT)是内源性凝血系统功能缺陷较为灵敏和常用的筛选指标，在监测肝素抗凝治疗中被广泛应用[1-4]。凝血因子Ⅷ是存在于血浆中的一种球蛋白，曾被称为抗血友病因子或抗血友病球蛋白，是内源性凝血途径中一种重要的凝血因子[5-6]。自2018年以来，Siemens公司陆续将APTT ACTIN试剂更换升级为APTT ACTIN FSL试剂，然而随着试剂成分发生变化，可能会导致检验结果随之改变，是否会影响APTT及Ⅷ因子的检测结果甚至影响临床诊疗判断，APTT及Ⅷ因子是否需要重新建立新的生物参考区间，是凝血专业工作者困惑和争议的话题，也是医学实验室需要重点关注的问题。因此，本文进行了相关试验研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择 2018年8月3月至2018年9月10日武汉大学人民医院住院患者及体检者共250例为研究对象，其中为建立参考区间收集体检者120例，年龄22～68岁，男67例，女53例。纳入、排除标准：过去5 d内未服用阿司匹林或含阿司匹林的药物、口服避孕药药物、抗血栓类药物(如巴曲酶等)，排除妊娠期或哺乳期、月经期，7 d内未做过手术，7 d内未献过血，1个月内未接受过输血，无溶血性贫血、再生障碍性贫血、凝血功能障碍等血液系统疾病，无胃癌、食管癌、肺癌、白血病等恶性肿瘤，无泌尿及生殖系统疾病，无红斑狼疮、风湿性关节炎等免疫系统疾病，无肝硬化、肝癌等严重肝脏疾病[7]。

1.2仪器与试剂 使用日本Sysmex 公司CS-5100 全自动血凝分析仪，试剂均为Siemens公司配套生产，包括APTT ACTIN(LOT：557248A)，APTT ACTIN FSL(LOT：556942)，氯化钙(LOT：563828)，质控品由Bio-Rad公司提供(LOT：78470)。由厂家授权的工程师每半年对仪器加样系统、温控系统及光学系统进行校准。参加湖北省卫生健康委员会室间质评成绩均合格，每日标本检测前对所有项目进行质控分析，确保所有项目均在控后再进行标本检测。

1.3方法

1.3.1标本采集 采用BD公司凝血专用0.109 mol/L 枸橼酸钠抗凝管抽静脉血至2.7 mL处,立即颠倒5～8次混匀,1 600 g 离心10 min，分离血浆。排除有凝块、溶血、脂血等异常情况。及时上机检测，在室温下进行检测并在4 h内完成[8]。

1.3.2指标检测 使用APTT ACTIN试剂检测患者血浆APTT，按照实验室APTT ACTIN原用参考区间20.0～40.0 s进行判断，选取20例标本(<20.0 s 7例，20.0～40.0 s 6例，>40.0 s 7例)，使用APTT ACTIN FSL试剂重新检测APTT。使用APTT ACTIN试剂检测患者血浆Ⅷ因子，按照实验室Ⅷ ACTIN原用参考区间70%～150% 进行判断，选取70例标本(<70% 2例，70%～150% 49例，>150% 19例)，使用APTT ACTIN FSL试剂重新检测Ⅷ因子。

1.3.3生物参考区间的建立 参照卫生行业标准[9]和临床实验室标准化协会(CLSI) C28-A3 文件推荐的方法[10],将120 例体检者血浆分别进行 APTT和Ⅷ因子检测，将所有测定结果先做数据离群点的判断，将疑似离群点和其邻点的差值D与数据全距R相除，求D/R比值，D/R=1/3为临界值，若D/R≥1/3，则该疑似离群点为离群值，应予以剔去。若有2个或以上的疑似离群点，将最小的疑似离群点作上述处理，若D/R≥1/3，则均为离群值，全部剔去；若D/R<1/3，则保留所有数据，剔除后须另外补齐体检健康者例数至120例[11-13]。

1.3.4新建参考区间的验证

1.3.4.1随机收集20例体检标本，统计各参考个体检测值，与新建立的参考区间比较，计算比率R

若R值≥95%，则生物参考区间或临床决定值被验证[14-15]。

1.3.4.2采用1.3.2中的70例患者及20例确诊静脉血栓或血友病的患者标本验证新建参考区间的适用性。

2 结 果

2.12种试剂检测APTT和Ⅷ因子的结果进行正态性检验分析 回顾性分析本实验室近期1 824例数据，运用SPSS软件进行正态性检验，结果显示,APTT ACTIN、APTT FSL和Ⅷ FSL均不符合正态分布，因此,2组间采用χ2检验进行百分率的比较。

2.2APTT和Ⅷ因子分别使用2种试剂检测阳性率的比较 取20例标本分别使用APTT ACTIN和APTT ACTIN FSL试剂检测APTT，采用APTT-ACTIN的参考区间20.0～40.0 s作为判断标准，APTT FSL和APTT ACTIN的阳性率分别为15.0%和60.0%，差异有统计学意义(P<0.01)，二者的阴阳性符合率为55.0%。取70例标本分别使用APTT ACTIN和APTT ACTIN FSL试剂检测Ⅷ因子，采用Ⅷ ACTIN的参考区间70%～150%作为判断标准，Ⅷ FSL和Ⅷ ACTIN的阳性率分别为61.4%和30.0%，差异有统计学意义(P<0.01)，二者的阴阳符合率为68.6%。见表1。

表1 2种试剂检测APTT和Ⅷ因子阳性率的比较(使用原参考区间)[%(n/n)]

注：与ACTIN试剂比较，aP<0.01。

2.3APTT和Ⅷ因子使用APTT ACTIN FSL试剂检测后分别重新建立新的生物参考区间 按照实验室原用APTT ACTIN检测的参考区间20.0～40.0 s和Ⅷ ACTIN检测的参考区间70%～150%进行判断，计算120 例入选合格体检者APTT的R值为100.0%(120/120)，Ⅷ因子的R值仅为79.2%(95/120)。采用百分位数法2.5%和97.5%的参考限作为生物参考区间，确定APTT FSL的新生物参考区间为25.2～32.6 s， Ⅷ FSL的新生物参考区间为60%～189%。

2.4使用APTT ACTIN FSL试剂及新生物参考区间进行性别分组比较R值 67例男性体检者及53例女性体检者2组之间APTTT FSL的R值分别为98.5%和96.2%，Ⅷ FSL的R值分别为95.5%和96.2%，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 使用APTT ACTIN FSL试剂及新生物参考区间进行性别分组比较R值[%(n/n)]

注：男女性比较，aP>0.05。

2.5随机选取20例体检标本验证新参考区间的适用性 随机选取20例体检标本使用新参考区间进行验证，APTT FSL的R值为95.0%(19/20),Ⅷ FSL的R值为100.0%(20/20)，所有验证的R值均≥95.0%。

2.6用普通患者标本验证参考区间的适用性 使用APTT ACTIN试剂采用原参考区间20.0～40.0 s及70%～150%，使用APTT ACTIN FSL试剂采用新生物参考区间25.2～32.6 s及60%～189%，分别重新对2.2中标本APTT和Ⅷ因子的检测结果进行阴阳性判断，20例标本APTT FSL和APTT ACTIN的阳性率分别为55.0%和60.0%,差异无统计学意义(P>0.05)，且二者阴阳符合率达到95.0%，显著升高(P<0.01)；70例标本Ⅷ FSL和Ⅷ ACTIN的阳性率为40.0%和30.0%，差异无统计学意义(P>0.05)，二者阴阳性符合率为90.0%，明显升高(P<0.01)。见表3。

表3 2种试剂检测APTT和Ⅷ因子阳性率的比较(使用新参考区间)[%(n/n)]

注：aP>0.05，bP<0.01。

2.7用确诊疾病患者的结果验证参考区间是否合适 采用新的参考区间对15例静脉血栓及5例血友病患者APTT及Ⅷ因子结果进行分析判断，结果显示，所有静脉血栓患者的APTT均<25.2 s，Ⅷ因子均>189%；所有血友病患者的APTT均>32.6 s，Ⅷ因子均<60%，且无漏诊病例出现。

3 讨 论

2018年以来，Siemens公司为了更好地提升产品的品质，陆续将APTT ACTIN试剂升级为APTT ACTIN FSL试剂，试剂成分的主要变化是在APTT ACTIN原有的磷脂成分兔脑粉中增添了提纯的大豆粉。厂家声明，APTT ACTIN FSL试剂与APTT ACTIN相比较具有更好的因子灵敏度和狼疮抗凝物灵敏度等优点。然而，试剂成分的变化是否会影响APTT及Ⅷ因子的检测结果，使用APTT ACTIN试剂检测APTT及Ⅷ因子时的生物参考区间是否仍然适用于新试剂，是每位检验工作者需要重点关注的事情，本实验室为APTT ACTIN FSL试剂对APTT及Ⅷ因子检测结果的影响进行了相关试验研究。

回顾性分析本实验室近期1 824例数据后发现，APTT ACTIN、APTT FSL和Ⅷ FSL均不符合正态分布，因此，2组间的比较均采用百分率进行比较。研究表明，当试剂升级为FSL之后，如果仍然使用原来APTT ACTIN和Ⅷ ACTIN的生物参考区间(分别为20.0～40.0 s及70%～150%)，2种试剂检测结果的阴阳性符合率太低(分别为55.0%和68.6%)，将会严重影响临床诊疗判断，无法满足临床需求。为此，实验室选取120例符合纳入标准的健康体检者，虽然APTT的R值达到了100.0%，但Ⅷ因子的R值仅为79.2%，必须重新建立新的生物参考区间。

重新建立APTT FSL和Ⅷ FSL的生物参考区间分别为25.2～32.6 s和60%～189%。改用新参考区间之后，2种试剂检测结果的阴阳性符合率均明显升高(P<0.01)，且均≥90.0%，120例健康体检者男女两组之间的R值亦无差异(P>0.05)。选取20例体检者对新参考区间进行验证，R值均≥95.0%，20例确诊静脉血栓或血友病的患者标本均无漏诊/误诊病例，经验证，新建参考区间适用有效。另外，在比较分别使用2种试剂后APTT及Ⅷ因子的生物参考区间时发现，当将试剂升级为APTT ACTIN FSL之后，APTT的参考区间范围比使用APTT ACTIN试剂时明显变窄，而Ⅷ因子的参考区间范围明显变宽，说明APTT ACTIN FSL试剂在正常标本的反应性较APTT ACTIN试剂更为稳定，凝固时间的变化对应于Ⅷ因子的幅度变化也更为合适，进而导致Ⅷ因子的参考范围更宽一些，由此也证实厂家声明的APTT ACTIN FSL试剂具有更好的因子灵敏度的优点。

4 结 论

为了降低临床漏诊及误诊风险，在使用Siemens公司APTT ACTIN试剂升级后的APTT ACTIN FSL试剂时，实验室检测APTT及Ⅷ因子时应修改或重新建立新的生物参考区间，并进行验证。