陆 巍，陶玉芬，程美慧，刘红旗

（1.中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所，昆明 650118；2.昆明医科大学，昆明 650000）

回归热是由赫姆斯疏螺旋体感染引起的一种多系统性疾病，除表现为菌血症和反复发热外，还可以引起中枢神经系统疾病[1]。通过对回归热螺旋体病原和致病机制的研究，发现了回归热螺旋体抗原在不同宿主[2]、宿主的不同部位和不同温度下的变异规律[3-4]，还证实了T细胞非依赖性B细胞免疫在控制该菌血症中的重要作用[5-7]。然而，由于疾病模型的缺乏，回归热螺旋体感染引起的该中枢神经系统疾病的机制还不是很清楚。我们的前期研究发现了一株回归热螺旋体感染正常的C57BL/6小鼠，能引起明显的中枢神经系统疾病症状，T细胞可能起关键性的作用[8]。不同品系的小鼠，由于其遗传背景尤其是MHC分子的差异，导致不同品系的小鼠对同一病原体感染的致病性不一样[9]。因此，本研究在前期研究基础之上，进一步探索宿主的遗传背景对回归热螺旋体感染模型的影响，为该疾病的动物模型和致病机制研究提供思路。

1 材料与方法

1.1 菌种回归热螺旋体Borrelia hermsiiDAH株由美国托马斯杰斐逊大学医学院根据美国NIH的协议馈赠。

1.2 主要试剂和设备BSK 培养基购自美国Sigma公司；96孔酶标板购自美国Corning公司；IgG检测试剂盒和IgM检测试剂盒购自Bethy Laboratories；酶标仪购自美国TECAN公司；暗视野显微镜购自日本Nikon公司；抗凝剂（1x ACD溶液）和样品稀释液（PBD缓冲液）由中国医学科学院医学生物学研究所感染与免疫实验室制备。

1.3 实验动物8～12周龄小鼠，选择3种不同遗传背景的小鼠：C57BL/6小鼠MHC分子的单倍体型是Hb，Balb/c小鼠MHC分子的单倍体型是Hd，ICR小鼠MHC分子的单倍体型是混合的。所有实验动物都是由本单位小实验动物部提供，实验动物生产许可证SCXK（滇）K2014-0002。

1.4 细菌的准备从-80℃冰箱取出1管（1500 μL）冻存的细菌。在常温手中握着融化（至刚好融化，但仍然是冷的）后，转移至灭菌的1.5 mL Ep管。于900×g室温离心6 min，以去除所有包括血小板和红细胞在内的细胞及细胞碎片。将上清转移至一新的Ep管，再于16 100×g室温离心6 min。然后用于37℃预热的500 uL无血清BSK-H悬浮细菌。在暗视野显微镜下计数并换算成10个视野下的平均菌体数（HPF）。用于感染的螺旋体，用BSK-H培养基稀释成5/HPF。用于ELISA板包被的螺旋体，用PBS稀释成1×106个细菌/mL。

1.5 实验动物感染8～12周龄小鼠，于感染前从尾部采血作为感染前样品，然后每只小鼠经腹腔注射200 μL 回归热赫姆斯疏螺旋体（66 700个螺旋体）。

1.6 血液样品采集和处理每只小鼠从感染的0～21 d，每天通过尾静脉采血5 μL，加入含45 μL抗凝剂的EP管混匀。吸取5 μL置于载玻片通过暗视野显微镜观察计数血液内菌体数量，计数10个视野取平均值。然后，于每管加入200 μL样品稀释液PBD并混匀后用于ELISA分析或放置于-80℃冰箱保存。

1.7 神经症状观察注射螺旋体后，每天由专人观察并记录小鼠的中枢神经系统症状[8]，根据症状的程度打分：“0”表示无明显的神经症状；“1”为尾巴无力或一个后肢无力；“2”为双后肢无力；“3”一个后肢麻痹；“4”为双后肢麻痹；“5”为因神经疾病引起的死亡。

1.8 螺旋体特异性IgM及IgG水平ELISA分析参照IgM和IgG检测试剂盒操作说明和参考文献进行。于96孔ELISA板中每孔加入50 000个热灭活的螺旋体DAH-p20，4℃、514×g离心20 min后，于4℃过夜包被。血液样本进行1:5稀释后用于ELISA检测，每份样品2个复孔，每孔加50 μL稀释后的血液样品。终止反应后，利用酶标仪检测样品OD450吸光度值，并通过标准曲线换算获得IgM和IgG的绝对量。

1.9 统计学作图利用Graphpad Prism 6 软件进行统计学分析和作图，用配对样品的t检验和参数检验分析不同遗传背景小鼠在感染赫姆斯疏螺旋体后的抗体和中枢神经系统疾病差异。

2 结果

2.1 回归热螺旋体在小鼠体内扩增螺旋体感染宿主后，能在血液中进行大量复制，形成不同程度的菌血症。因此，我们在感染后不同的时间里收集血液样本，在暗视野显微镜下计数细菌。结果发现，回归热螺旋体Borrelia hermsiiDAH株经腹腔感染3种不同遗传背景小鼠后，菌体在体内的复制均在2～3 d达到高峰值，之后，细菌数量迅速下降，有的甚至观察不到。1～2 d后，细菌在体内复制又开始回升，并形成一个比首次峰低一点的峰。随着感染的进行，细菌在体内复制呈现出反复增高和降低的模式。不管是细菌在体内复制所达到的峰值还是反复增高和减低的模式，其在3种不同遗传背景小鼠之间的差异不具备统计学意义（图1）。

图1 回归热螺旋体感染引起小鼠的菌血症Fig.1 Bacteremia in mice infected by RF Borrelia hermsii

2.2 回归热螺旋体感染引起中枢神经疾病症状我们的前期研究报道，回归热螺旋体Borrelia hermsiiDAH株感染免疫正常的C57BL/6小鼠能引起明显的、严重的中枢神经系统疾病症状。因此，本研究继续观察该株细菌能否在其他遗传背景的小鼠中引起类似症状。结果表明，C57BL/6小鼠经回归热螺旋体Borrelia hermsiiDAH株腹腔注射后，于第7 d开始出现轻度神经症状，表现为尾部耷拉无力，随着感染的进程，小鼠表现为单侧或双侧后肢无力、麻痹，单侧或双侧前肢无力和麻痹。这种中枢神经疾病症状于感染后2 w左右最为严重。感染后第3周，有的开始慢慢恢复，有的还保持在一个严重的水平，这些与我们的前期报道一致。ICR小鼠中有一只在感染后第7 d也开始出现轻度神经症状，然而在整个观察期内症状不是很严重，只是出现双后肢无力，没有出现麻痹的情况。Balb/c小鼠在整个感染后第21 d观察期内没有出现任何神经症状（图2）。C57BL/6小鼠与ICR小鼠之间差异具有统计学意义（p＜0.05）。

图2 回归热螺旋体感染引起小鼠的神经系统疾病症状Fig. 2 Neurological symptoms induced by infection of RFBorrelia hermsii

2.3 回归热螺旋体特异性抗体回归热螺旋体感染3种不同遗传背景的小鼠后，均能诱导回归热螺旋体特异性抗体IgG和IgM的产生（图3）。IgM首先被诱导产生，从感染后第3 d开始能检测到回归热螺旋体特异性IgM，第5 d达到最高水平，之后开始下降；在感染后2 w左右，IgM水平降至最低，然后又开始上升达到一个相对低的峰值，有一个反复上升和下降的趋势（图3A）。IgG出现于感染后第6 d，且在21 d的实验期内一直保持一种上升的趋势（图3B）。3种小鼠之间比较发现，C57BL/6小鼠中IgG总体水平低而IgM水平高，ICR小鼠与C57BL/6小鼠的刚好相反。C57BL/6小鼠产生的IgG和IgM都与Balb/c小鼠、ICR小鼠之间差异具有显著统计学意义（p＜0.05）。

图3 回归热螺旋体特异性抗体IgM(A)和IgG(B)Fig.3 RF Borrelia hermsii-specific antibodies IgM(A) and IgG(B)

3 讨论

回归热螺旋体感染能引起包括中枢神经系统疾病在内的多系统疾病的发生。为了更好地研究回归热螺旋体的感染和致病机制，已经成功地研发了多个小鼠的模型，包括免疫缺陷小鼠模型和人源化小鼠模型。然而，不同的人感染该螺旋体后，临床上所表现的症状不同，这与宿主的遗传易感性或免疫状况可能有一定的关系。C57BL/6背景的小鼠模型能较好地模拟临床上细菌的复制、抗体产生[10]和中枢神经系统疾病症状[8]。本研究进一步比较了一株能引起中枢神经系统疾病回归热螺旋体感染C57BL/6小鼠和其它两种常用小鼠Balb/c和ICR后，螺旋体在体内的复制情况和诱导螺旋体特异性抗体的产生，以及引起的中枢神经系统疾病症状。结果表明，该螺旋体菌株在小鼠体内均能较好地复制，并诱导相应的抗体产生，且3种不同遗传背景小鼠之间无明显的差别。然而，从螺旋体感染诱导的中枢神经系统疾病症状来看，C57BL/6小鼠表现最为严重，其次是ICR，而Balb/c小鼠在整个观察期都不表现任何明显的神经症状。

本研究的3种小鼠在感染了回归热螺旋体后第3 d开始均出现了特异性的IgM，且有反复升高和降低的趋势。IgG从第6 d起一直呈上升的趋势，这些提示了回归热螺旋体特异性的IgM而不是IgG对于控制菌血症起主要作用，与已报道的结果基本一致[11]。

主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）是宿主细胞表面一种非常重要的糖蛋白，通过提呈抗原肽给细胞毒T细胞或效应T细胞来调节机体的免疫反应[12]。因此，MHC分子的多态性与宿主对疾病的易感性等相关[13-16]。MHC分子在人细胞中叫人白细胞抗原复合物（human leukocyte antigen complex，HLA）。小鼠的MHC分子发现于60多年前，是目前进行MHC相关研究的主要动物模型[17]。不同遗传背景小鼠的MHC分子的单倍型（haplotype）是不一样，如：C57BL/6小鼠为H2b，而Balb/c小鼠的为H2d。MHC分子的不同导致了这2种小鼠对病原的易感性和致病性的差异[9]。本研究结果表明Balb/c小鼠对螺旋体的中枢神经系统致病的易感性较C57BL/6的低（图2），这可能与2种小鼠MHC分子的H2单倍体型有关系。而ICR小鼠为封闭群（outbred）小鼠，其MHC分子成分更为复杂，全基因组相关性分析表明，商业化的封闭群小鼠的MHC分子单倍型基因片段的42%～80%可能来自近交系（inbred）小鼠[18]。来自ICR小鼠的小胶质细胞对LPS刺激的反应较近交系小鼠C57BL/6的更为强烈[19]。

综上所述，本研究验证了C57BL/6小鼠是研究回归热螺旋体中枢神经系统疾病的理想实验动物，同时，小鼠遗传背景的差异对实验研究结果会带来较大差异，选择合适品系的小鼠作为实验研究对象显得至关重要。此外，C57BL/6小鼠还是目前进行基因操作的主要小鼠，绝大部分的转基因小鼠和基因缺失小鼠都是在此背景小鼠里建立起来的，这有利于我们利用C57BL/6基因修饰小鼠进一步地探索回归热螺旋体中枢神经系统疾病的致病机制。