任博雯，刘 琰，刘晓雷，白 雪，丁 静，张胜兰，刘明远

（吉林大学人兽共患病研究所 人兽共患病研究教育部重点实验室，长春 130062）

旋毛虫病（Trichinellosis）是由旋毛虫（Trichinella spiralis）引起的一种危害严重的食源性人兽共患寄生虫病[1]，可在包括人类在内的多种哺乳动物之间广泛传播，严重时可以导致患者死亡[2]。旋毛虫病不仅对人类健康构成严重威胁，而且给养殖业和肉类出口也造成重大的经济损失。因此，研发一种简单、便捷、快速、特异性高的旋毛虫病检测方法，对保障人民身体健康、国际肉类贸易和降低畜牧业的经济损失有重要意义。ELISA检测法是国际兽医局（office international des epizooties，OIE）目前唯一推荐使用的、针对旋毛虫感染的血清学检测方法[3]。该方法的灵敏性及特异性主要取决于诊断抗原，因此找到优质抗原是ELISA检测旋毛虫感染的关键。

旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂可以通过其独特的酶抑制活性，来抵抗宿主肠道消化酶对虫体的损伤，进而使其成功寄生在宿主体内。血吸虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂可以与凝血因子结合，抑制宿主的血液凝固，有利于血吸虫在宿主体内摄取营养[4]。除此之外，丝氨酸蛋白酶抑制剂还具有调节宿主对旋毛虫的免疫应答和炎性反应等作用[5]，但是关于旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的免疫保护性分析未见系统的研究。本实验室前期对旋毛虫不同发育时期cDNA表达文库进行免疫学筛选，获得了肌幼虫时期的高丰度强反应原性抗原rTs-serpin（GenBank登录号：DQ864973.2）并构建了原核表达载体[6]，本研究中我们对该重组抗原进行了表达纯化，着重研究丝氨酸蛋白酶抑制剂的抗原性及虫体定位，并对其免疫保护效果进行了初步评估。

1 材料与方法

1.1 旋毛虫及旋毛虫感染猪血清样本、实验动物来源旋毛虫（T.spiralisISS534）由吉林大学人兽共患病研究所食源性寄生虫病研究室使用ICR小鼠传代保存；各感染时间的猪血清样本由实验室前期制备。所有动物实验流程由吉林大学伦理委员会批准；体重为2～2.5 kg的新西兰白兔和体重18～22 g雌性BALB/c小鼠均购自吉林大学基础医学院动物实验中心。

1.2 主要试剂IPTG、卡那霉素、咪唑等购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；一次性滤器（0.45 μm）购自美国Millipore公司；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均购自美国Sigma-Aldrich公司；Hoechst33342购自碧云天生物技术有限公司；HRP标记的羊抗猪IgG抗体购自美国Jackson公司，HRP标记的羊抗兔IgG抗体购自Bio World公司；多聚甲醛、甲醇均购自北京化工厂；ECL发光试剂盒购自美国Pierce公司；His-Trap纯化柱购自于美国GE Healthcare公司；ELISA板购自COSTAR公司。

1.3 rTs-serpin的大量表达与纯化将实验室保存的pET-28a-Ts-serpin/BL21（DE3）活化，接种于1 L LB培养基（终浓度50 μg/mL 卡那霉素）中扩大培养，测其A600的值在0.4～0.8时加1 mL IPTG（IPTG终浓度为1 mmol/L）进行诱导表达。将诱导后菌液离心并超声破碎至澄清，离心分离上清和包涵体。将包涵体用Binding Buffer溶解后用0.45 μm滤器过滤，将滤液放在4℃冰箱保存准备纯化。将带有His标签的rTs-serpin采用AKTA purifier100（美国 GE Healthcare公司）纯化系统纯化。分别用含有30、50、100、300、500 mmol/L咪唑的Elution Buffer洗脱，取洗脱样品进行SDS-PAGE鉴定。

1.4 rTs-serpin反应原性鉴定将纯化后的rTs-serpin进行SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭。将感染剂量为10 000条旋毛虫肌幼虫、感染后不同天数（days after infection，dpi）（0、20、30、45、60、90、120 dpi）的猪血清样本稀释400倍作为一抗，4℃孵育过夜。将HRP标记的羊抗猪IgG用封闭液稀释2000倍作为二抗，室温孵育2 h。最后加入ECL化学发光试剂于成像系统下观察。

1.5 多克隆抗体的制备和效价测定免疫前采兔耳缘静脉血作为阴性血清，取纯化后浓度为1 mg/mL的rTs-serpin与弗氏完全佐剂按1:1的比例完全乳化后在背部皮下多点注射，第2、3、4次免疫使用弗氏不完全佐剂，两周免疫一次。待抗体效价到达标准后加强免疫，收集并纯化血清，于-80℃冰箱保存备用。采用间接ELISA方法，测定抗体血清效价。稀释rTs-serpin至5 μg/mL进行包被，将免疫前收集的阴性血清作为对照，梯度稀释后（稀释倍数如图4所示）的免疫血清作为一抗，将HRP标记的羊抗兔IgG稀释10 000倍作为二抗，进行多克隆抗体的效价测定。

1.6 多克隆抗体的Westerrn blot鉴定将旋毛虫肌幼虫排泄分泌产物（excretion secretion，ES）和肌幼虫虫体蛋白进行Western blot分析，其中一抗为稀释2000倍的多克隆抗体和稀释2000倍的免疫前兔血清，二抗为稀释10 000倍的HRP标记的羊抗兔IgG。

1.7 免疫荧光定位取感染后第36 d的小鼠进行集样消化法得到旋毛虫肌幼虫，免疫前兔血清作为阴性对照、兔抗rTs-serpin血清（1∶200）作为一抗，4℃孵育过夜。Alexa Flour594标记羊抗兔IgG（1∶1 000）为二抗，室温避光孵育45 min。随后用Hoechst 33342室温复染5 min，洗涤后在荧光显微镜下观察。

1.8 rTs-serpin的免疫保护效果评估首次免疫将浓度为0.1 mg/mL的rTs-serpin与弗氏完全佐剂等体积混匀乳化后皮下注射小鼠200 μL，并设置佐剂对照组和PBS对照组。加强免疫两次，两周一次。收集免疫前和免疫后的鼠血清，并用间接ELISA方法检测IgG抗体水平。最后一次免疫两周后，对小鼠进行攻虫（200条/只），感染后第36 d后通过集样消化法对肌幼虫计数，计算减虫率。肌幼虫减虫率（%）=1-（实验组小鼠平均肌幼虫数/PBS对照组小鼠平均肌幼虫数）×100%。

2 结果

2.1 rTs-serpin表达与纯化pET-28a-Ts-serpin/BL21（DE3）经IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析，在37 kDa左右位置出现目的带，与预期大小相符，目的蛋白在包涵体中得到高效表达（图1）。重组蛋白经过不同浓度的咪唑洗脱后，SDS-PAGE结果表明300 mmol/L咪唑洗脱的蛋白浓度较高，洗脱比较完全（图2A）。梯度透析至PBS缓冲液后，经SDSPAGE鉴定只在37 kDa处有单一条带（图2B）。

2.2 rTs-serpin的Western blot鉴定rTs-serpin的Westerrn blot结果表明，纯化后的rTs-serpin可被感染10 000条肌幼虫后不同天数的猪血清特异性识别，而与猪血清呈阴性反应（图3）。rTs-serpin有良好的反应原性，在感染20 dpi即可看见明显的反应条带，说明rTs-serpin可作为早期检测旋毛虫病的候选抗原。

图1 rTs-serpin表达与可溶性分析Fig.1 rTs-serpin expression and solubility analysis

2.3 多克隆抗体效价测定和Western blot分析用间接ELISA方法检测多克隆抗体的效价为1∶160 000（图4），免疫效果良好。

2.4 多克隆抗体的Western blot分析在虫体蛋白和ES的Western blot检测中，发现rTs-serpin多克隆抗体能够同时识别旋毛虫虫体粗抗原和ES产物中的Tsserpin，且条带大小与理论分子量相符（图5A），而阴性兔血清对照组膜上无条带（图5B）。ES中存在这种抗原，说明rTS-serpin是一种分泌蛋白。

2.5 免疫荧光定位用纯化的兔抗rTs-serpin血清进行旋毛虫肌幼虫虫体的免疫荧光定位，结果表明，多克隆抗体作为一抗的旋毛虫肌幼虫表皮有明显的红色荧光信号（图6A），而阴性兔血清未见荧光信号（图6B）。

2.6 rTs-serpin的免疫保护效果评估间接ELISA检测免疫后各个时间点抗体IgG水平的变化（图7），发现二次免疫后小鼠血清中IgG水平明显高于对照组。将免疫后并攻虫的小鼠采用集样消化法消化，并计算减虫率。rTs-serpin免疫的小鼠与PBS、佐剂对照组相比，肌幼虫数量减少（P＜0.05），与PBS对照组相比减虫率为32.2%（图8）。

图2 rTs-serpin的SDS-PAGE鉴定Fig.2 SDS-PAGE identification of rTs-serpin

图3 Western blot分析rTs-serpin反应原性Fig 3 Western blot analysis of rTs-serpin reaction-like

图4 重组蛋白rTs-serpin多克隆抗体效价分析Fig.4 Analysis of titer of recombinant protein rTs-serpin polyclonal antibody

图5 rTs-serpin多克隆抗体的Western blot分析Fig.5 Western blot analysis of rTs-serpin polyclonal antibody

图6 rTs-serpin在旋毛虫肌幼虫时期虫体定位（×100）Fig.6 Location of rTs-serpin in Trichinella spiralis muscle larvae (×100)

A: 不同咪唑浓度洗脱液SDS-PAGE. M: 蛋白分子量标准(100 kDa); 1: rTs-serpin洗涤后包涵体; 2: 30 mmol/L咪唑洗脱峰; 3:50 mmol/L咪唑洗脱峰; 4: 100 mmol/L咪唑洗脱峰; 5:300 mmol/L咪唑洗脱峰; 6: 500 mmol/L咪唑洗脱峰

B: 复性纯化后rTs-serpin SDS-PAGE. M: 蛋白分子量标准（100 kDa); 7: 复性纯化后rTs-serpin

A: Different imidazole concentration eluent SDS-PAGE. M: DNA Marker(100kDa); 1: rTs-serpin washed inclusion body; 2:30 mmol/L imidazole elution peak; 3: 50 mmol/L imidazole elution peak; 4: 100 mmol/L imidazole elution peak; 5:300 mmol/L imidazole elution peak; 6: 500 mmol/L imidazole elution peak

B: Renaturation and purification rTs-serpin SDS-PAGE. M: DNA Marker(100 kDa); 7: rTs-serpin after renaturation

图7 rTs-serpin免疫后小鼠IgG抗体水平分析Fig.7 Analysis of mouse IgG antibody levels after rTs-serpin immunization

图8 rTs-serpin免疫后肌幼虫减虫率分析Fig.8 Analysis of worm reduction rate of muscle larvae after rTs-serpin immunization

3 讨论

目前，Lin等[7]建立的qPCR和LAMP方法和Li等[8]建立的LF-RPA方法均可用于检测旋毛虫病，但是这些方法灵敏度较低，同时也受仪器和操作方式的限制，不适用于现场检测。以肌幼虫ES抗原建立的ELISA检测方法是目前OIE推荐的血清学方法[9]，然而这种方法存在诊断盲区，只能检测感染后30 d等的阳性血清[10]。目前以肌幼虫ES抗原建立的方法仅应用于流行病学检测，因此为旋毛虫病早期诊断和检测找到一种优质抗原仍是目前ELISA方法需要解决的问题。基因工程抗原有易于大量生产且成分单一有利于纯化等优点，目前已经从旋毛虫cDNA[11]文库发现多个具有良好抗原性的基因，并利用DNA重组技术克隆表达了多种旋毛虫不同时期的功能抗原[12]，如DNaseII-T3223-7[13]、T668定点突变蛋白[14]、重组蛋白TsSP[15]等。本试验将表达纯化后rTs-serpin与感染旋毛虫不同天数的猪血清进行Western blot分析，结果表明rTs-serpin有良好的反应原性，可以作为诊断猪旋毛虫病的候选抗原。

丝氨酸蛋白酶抑制剂有抑制凝血、诱发炎性反应和参与寄生虫免疫逃避[16-17]等多种生物学功能。丝氨酸蛋白酶抑制剂在钩虫中有抗凝血作用，有助于虫体从宿主内摄取营养，可以提高钩虫的免疫防御能力[4]。在埃及血吸虫中，丝氨酸蛋白酶抑制剂可与人的胰蛋白酶结合来降低虫体的免疫原性，从而使其达到免疫逃避的目的[18]。此外，有研究发现，旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂TsAdSPI可以抑制糜蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶的活性，来抵御宿主的消化系统对虫体的损害[19]。吴秀萍等[6]证明Ts-serpin主要存在于旋毛虫肌幼虫时期，少量存在于新生幼虫时期，并在旋毛虫生命周期发挥重要作用。在本研究中，Western blot结果显示旋毛虫肌幼虫ES抗原和虫体粗抗原均存在Ts-serpin。随后，利用多克隆抗体进行免疫荧光定位，发现Ts-serpin主要分布在旋毛虫肌幼虫表皮中，表明Ts-serpin是一种分泌型抗原。另一方面，刘照琨等[20]利用旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂（TsKaSPI）重组蛋白免疫小鼠，具有一定的成虫减虫率，使小鼠获得免疫保护效果。本实验研究发现，rTs-serpin免疫后的小鼠肌幼虫减虫率约为32.2%，说明rTs-serpin免疫后的小鼠对旋毛虫肌幼虫的感染产生了一定的免疫保护作用，可将Tsserpin作为潜在的候选疫苗靶标。

综上，本研究结果表明制备的rTs-serpin具有较强的反应原性，且可以被旋毛虫早期感染血清识别，为下一步研发旋毛虫的诊断方法提供了候选抗原。间接免疫荧光定位显示Ts-serpin主要在虫体表皮中，免疫保护试验结果表明Ts-serpin可作为旋毛虫基因工程疫苗研究的候选靶标。