雷元元，郭亚男，郭 磊，郭鹏辉，何生虎

（1.延安市动物疫病预防控制中心，延安 716000；2.宁夏大学农学院，银川 750021；3.宁夏晓鸣农牧股份有限公司，银川750021）

鸡滑液囊支原体病是由鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS）感染所引起的一种以跗关节渗出性的滑液囊膜炎及腱鞘滑膜炎为特征的急性或慢性传染病[1]。该病季节性不明显，但以冬春季多发，病鸡和带毒鸡为主要的传染源，鸡感染后不但可通过呼吸道进行同群间水平传播，也可通过卵进行垂直传播，能够降低蛋鸡产蛋率、蛋品质和孵化率，降低饲料转化率，使屠体废弃率升高[2]。有报到显示，美国商品蛋鸡普遍感染[3]，西欧弗兰德斯地区感染率达76.3%[4]，但没有种鸡感染的相关报道。2008年国内鸡滑液囊支原体的感染率达到20.7%[5]，近两年在广东省、广西壮族自治区、湖北省、山东省、辽宁省、河北省、山东省、河南省、山西省等地各品种的鸡均有感染滑液囊支原体，且感染率在逐渐增加[6-7]，江苏省[8]部分地区鸡群血清阳性率最高达到82.4%，最低为38.9%，平均阳性率为57.7%，可见MS感染给我国养禽业造成了巨大的经济损失，同时严重影响了养禽业的可持续发展，必须引起人们的高度重视。

1 材料与方法

1.1 病料无菌采集发病鸡的跗关节液、血液、血清、脾脏、卵巢等有病理变化的组织样品，种蛋，1日龄小鸡的卵黄、肺脏、喉头气管。

1.2 鸡场流行病学调查通过询问的方式对养殖场商品鸡来源、饲养规模、饲养方式、发病情况、发病率及死亡率等内容进行初步掌握。

1.3 临床症状及其剖解病理变化观察场区鸡群整体情况，精神状态、临床症状，对病危鸡进行剖解，观察剖解病变。

1.4 抗体检测按试剂盒说明书中方法将鸡群中采集的100份（病鸡50份，同群鸡50份）血清进行抗体滴度检测。

1.5 病原分离及纯化将无菌采集的跗关节内容物、肺脏等病变组织同时接种改良的Frey氏固体、液体培养基[9]，在37℃、8%CO2条件下培养3～5 d，观察是否有“煎蛋样”菌落生长，在固体培养基上取单个菌落进行传递培养，对菌落进行纯化。

1.6 PCR病原学检测取纯化后的液体培养物按质粒提取试剂盒说明书中方法提取核酸，参照参考文献[1]，根据GenBank中收录的鸡滑液囊支原体WVU 1853（ATCC 25204）株（GenBank登陆号：N-R044811）16S rRNA基因序列合成引物，进行PCR扩增病原体的16 s rRNA，以实验室收藏菌株为阳性对照。

1.7 病理模型的建立本实验室根据文献[10]将本次分离纯化后的菌株分别通过呼吸道、消化道、皮下等不同感染途径对6周龄幼鸡进行感染，对感染幼鸡各项指标进行实时检测，观察感染后的病理变化。

1.8 垂直传播的验证该厂区耐过鸡群开产后随机选50只鸡在137日龄进行人工授精，授精后3 d内收集100枚种蛋进行孵化，孵化到21日龄出壳时处死小鸡（未出壳的弱雏、畸形等作同样的处理）取卵黄、肺脏、喉头器官进行PCR检测。

2 结果与讨论

2.1 鸡场发病情况调查结果2016年10月初甘肃省张掖市某商品鸡场饲养褐色海兰鸡13 000羽，雏鸡未进行支原体免疫，20日龄左右雏鸡群出现采食量降低，陆续出现鸡只羽毛蓬松、精神萎靡、喜卧、跛行，通过饮水用VC、氟苯尼考进行治疗，未见明显效果，用泰万菌素和泰妙菌素治疗后起到一定作用。而63日龄鸡群发病6200羽，死亡2300羽，淘汰6200羽，发病率48%，病死率37%，死淘率48%。现场调查结果显示：该鸡场主要以笼养为主（图1），饲养密度偏大，远离交通主干道，但场内环境差，场区没有任何生物安全措施，该鸡舍取暖方式为火炉，整个鸡舍受热不均匀，人员进出鸡舍没有任何消毒措施，死淘鸡全部堆在鸡舍门口，未及时进行无害化处理，鸡舍粪污处理不及时，导致舍内环境恶劣，氨气含量超标。

有研究表明：28～120日龄鸡群较其他日龄鸡群最为易感MS[11]；不同鸡群对MS抵抗力也有差别，引进品种或品系的鸡发病率要高于本土品种，商品代蛋鸡群MS感染阳性率高于父母代，父母代比祖代要高[12]。鸡群感染MS后多以隐性经过，并不表现出临床症状，当饲养管理不当引起鸡群免疫力下降、鸡群受应激条件的影响、MS与其他疫病混合感染时均可促进MS的爆发[13]。该商品鸡场不注意生物安全，环境条件差，病死鸡没有及时无害化处理，鸡舍取暖不均匀，较强的应激是引起本疫情的主要原因。

图1 鸡场现场Fig.1 The scene picture of chicken farm

2.2 病鸡临床症状及部分剖解病变病鸡在临床上表现为精神萎靡（图2A）、羽毛蓬松、采食量下降、站立不稳、喜卧、跛行，全身检查可见双侧关键明显肿大（图2B），剖解关节流出黄色的脓性液体（图2C），对发病鸡进行剖解，可见肝脏颜色变深（图2D），脆性增大，肌腺胃部糜烂、出血（图2E），脾脏肿大（图2F），内部严重出血（图2G），卵巢轻度出血、喉头气管轻度出血（图2H）等典型的临床症状，这与参考文献[5]中禽滑液囊支原体临床结果类似，初步诊断为禽滑液囊支原体。

2.3 抗体检测结果按试剂盒说明书中方法将鸡群中采集的100份血清（病鸡50份，同群鸡50份）进行抗体滴度检测（表1）。经检测100份全部阳性，阳性率100%，由于鸡群没有支原体免疫史，说明鸡群中有支原体的入侵。

2.4 病原体分离结果将无菌采集的跗关节液、脾脏、卵巢等器官分别接种改良的 Frey 氏固体、液体培养基，在37℃、8% CO2条件下培养，5 d后在4×10倍的显微镜下可见，接种过跗关节液和卵巢的固体培养基长出菌落，但“煎蛋样”不太明显（图3a），液体培养基颜色由红变黄，对固体液体培养物进行传代纯化，固体培养物5代后在4×10倍的显微镜下出现了典型的“煎蛋样”菌落（图3b），液体培养物在3代后培养周期缩短到3 d，培养3 d培养物变为澄清透明的黄色液体（图4）。

图2 临床病理变化Fig. 2 Clinical pathological lesions

表1 抗体检测结果Table 1 The results of antibody test

图3 纯化前后“煎蛋样”菌落（40×）Fig. 3 Fried eggs colonies before and after purification

图4 纯化前后 Frey 氏液体培养基生长情况Fig. 4 Growth of Frey's liquid medium before and after purification

2.5 病原体PCR检测结果经PCR扩增，阳性对照与纯化产物均得到1077 bp大小的片段（图5）。由于支原体对培养基营养要求高，培养周期长，培养过程中容易被其他病原微生物污染，临床采集的病料受多种病原微生物污染，分离纯化较困难，这就给MS的研究带来一定困难，本研究借助宁夏大学农学院临床兽医学实验室多年来对支原体研究基础，成功从临床上分离到滑液囊支原体病原，缩短培养周期，纯化后得到典型的“煎蛋样”菌落，经PCR进一步验证该培养物为滑液囊支原体，该结果为禽滑液囊支原体的临床诊断、防控、科学研究奠定了坚实的基础。

2.6 病理模型的建立对感染后幼鸡进行各项指标实时监测、剖解并分离病原体。结果显示，鸡滑液囊支原体在鸡体感染的病理模型复制成功，该结果进一步证实上述病例为滑液囊支原体感染。

2.7 雏鸡病料PCR检测结果共检测雏鸡的喉头、肺脏混合物98份，采取方法首轮PCR将9份病料模板合为一起作为模板（图6），若扩增阳性，再将9份病料模板一一扩增检测。最终确定98份样品中强阳性2份，弱阳性7份，阳性率为9.2%；卵黄共检测98份，阳性0份，阳性率0。从商品蛋孵化出的1日龄雏鸡的肺脏和喉头器官中能检测到MS，证实了MS的垂直传播特性。MS一旦感染，终身带毒。

图5 培养物PCR检测结果Fig. 5 PCR results of the culture

图6 雏鸡喉头、肺脏PCR检测结果Fig. 6 PCR Results test of chick throat and lung

商品鸡场为了有效防控MS的发生，确保种源的安全，从支原体净化示范场引种，从源头上控制MS的发生；其次，在本场建立完善的生物安全体系[14]，防治其他病原菌的感染而引起MS的发生，加强饲养管理，提高机体免疫力，抓鸡、转群尽量降低对鸡群的应激；最后，对引进雏鸡检测MS母源抗体，对母源抗体不高的鸡群及时免疫，增加抗体，同时不定期饲喂Vc提高免疫力，当发病时及时饲喂泰勒菌素、泰万菌素[15]以缓解疫情。