梁栋 刘光亮 王永 马兴华 石屹 王树声 王程栋

摘  要：为了解干旱胁迫对烟草不同部位细胞程序化死亡的影响，以中烟100（不耐旱）和农大202（耐旱）为材料，采用2.5% PEG-6000模拟干旱，分析了不同耐旱性材料表型差异，用DNA Ladder法、TUNEL法测定烟草不同部位细胞程序化死亡发生的时间及程度差异。结果表明：（1）干旱胁迫下，农大202和中烟100的生物量、根长、根直径均较对照下降，其中中烟100下降幅度更大且与对照达到极显著差异;（2）中烟100在干旱胁迫第3天，各部位均已发生PCD，但是不同部位对干旱胁迫的响应不同，叶片、侧根的PCD发生程度相近，根尖细胞发生程度明显高于叶片及侧根;（3）根据定位观察可知侧根皮层细胞以及远离叶脉的细胞较早发生PCD;（4）烟草的耐旱性越强，PCD发生较迟，发生程度也越弱。综上所述，干旱胁迫下烟草不同部位细胞发生PCD的时间和特征是有差异的，耐旱性不同的品种发生PCD的时间也是有差异的。

关键词：烟草;干旱胁迫;细胞程序化死亡

Abstract： To understand the effects of drought stress on programmed cell death in different parts of tobacco plants， using Zhongyan 100 （not drought-tolerant） and Nongda 202 （drought-tolerant） as materials， 2.5% PEG-6000 was used to simulate drought stress in analyzing phenotypic difference between plants with different drought tolerance. DNA Ladder method and TUNEL method were used to determine the time and degree of programmed cell death in different parts of tobacco plants. The results showed that： （1） Under drought stress， the biomass， root length and root diameter of Nongda202 and Zhongyan100 decreased compared with the control. The decrease range of Zhongyan100 was larger and the difference with the control was extremely significant. （2） On the third day of drought treatment， PCD had occurred in all parts of Zhongyan 100 plants， but the response of different parts to drought stress was different. The degree of PCD in leaves and lateral roots was similar， and the degree of PCD in root tip cells was significantly higher than that in leaves and lateral roots. （3） According to the localization observation， cells of the lateral root cortex and cells far away from the veins developed PCD earlier. （4） Tobacco plants with higher drought tolerance showed later occurrence of PCD and weaker degree of occurrence. In summary， the time and characteristics of PCD in cells of different parts of tobacco plants under drought stress are different， and the time of PCD in plants with different drought tolerance is also different.

Keywords： tobacco; drought stress; programmed cell death

干旱对我国农业生产形成巨大威胁，有研究表明其对作物造成的减产量可超过其他自然逆境减产量之和[1]，并且干旱在我国各个烟草种植大省中普遍发生，严重影响了我国烟草的产量与品质。研究干旱胁迫对烟草不同部位细胞程序化死亡（PCD）的影响，对于了解细胞程序化死亡信号转导机制进而探究植物对干旱逆境的响应具有重要意义。

细胞的死亡在植物的整个生长发育过程中都普遍存在。一般把细胞的死亡分为2种类型：坏死（necrosis）和细胞程序化死亡（programmed cell death，PCD）[2]。坏死（necrosis）是一种被动的非正常死亡方式，指受到来自外界环境的强烈刺激，从而造成细胞膜通透性增加，内质网扩张，核染色质不规则移位，进而产生线粒体及核肿胀，溶酶体破坏，细胞膜破裂，胞浆外溢等现象[3]。细胞程序化死亡（PCD）是细胞在发育过程中或在某些环境因素作用下发生的，受基因调控的、主动的、有序的死亡方式[4]。检测细胞发生PCD的方式有很多。如细胞外形褶皱，细胞核变小，核形态发生改变呈新月状[5]等形态特征可以作为判断細胞发生PCD的依据。植物细胞发生PCD时，钙-镁依赖的核酸内切酶可切割细胞核DNA在核小体间断裂形成具有180～200 bp及其倍数的DNA片段，从而在琼脂糖凝胶电泳上呈现特殊的DNA Ladder条带[6]。此外，通过TUNEL（荧光）的方法，经荧光素标记后的发生PCD的细胞，细胞核在荧光显微镜下呈现较强的绿色荧光，而正常细胞与坏死细胞因DNA断裂很少，几乎没有荧光[7]。

PCD在植物体中起着十分重要的作用，植物从胚胎发育到器官的形成都伴随PCD现象的发生[8]。已有研究表明，病原物侵染[9]、干旱胁迫[10]、涝害[11]和重金属胁迫[12]等都会引起植物的PCD反应，植物通过这种反应来减轻逆境对植物体的伤害，增强对植物的适应性，提高生存能力。胁迫与PCD的发生密切相关，持续的胁迫会使烤烟叶肉细胞叶绿体超微结构、多酚物质含量及PAL和PPO活性发生重大变化，进而影响烟株的生长[13-14]。目前大多数研究都集中在对细胞程序化死亡的相关基因功能鉴定、特征产物分析、形态学、生理生化特征的描述等，而对于植物不同部位细胞的PCD反应程度以及反应时间差异的研究较少。因此，本研究以抗旱性不同的两个烟草品种为材料，采用水培试验模拟干旱，检测不同时间下烟草不同部位的PCD的特征，以探讨不同部位PCD响应之间的差异，为烟草逆境生长提供理论基础。

1  材料与方法

1.1  供试材料

烟草品种中烟100及农大202由国家农作物种质资源平台烟草种质资源子平台（中国农业科学院烟草研究所）提供。根据本实验室前期研究结果[15-16]，对5个烤烟品种苗期水分胁迫下各种生理指标和光合特性变化进行测定，按抗旱能力差异分类后将中烟100定义为不耐旱品种，而将农大202定义为耐旱品种。

1.2  研究地点与方法

1.2.1  试验地点  中国农业科学院烟草研究所即墨试验基地。

1.2.2  试验处理  将中烟100及农大202的种子消毒后播种到基质（泥炭和蛭石比例为1∶1）中。4叶1心时，选取长势一致幼苗，移栽于含1/4 霍格蘭营养液（pH 5.5）的周转箱（7 L）水培处理，每个周转箱里面培养10株烟苗，缓苗3 d后开始处理：对照处理和2.5% PEG-6000处理（渗透势约为–0.08 Mpa，相当于中度干旱）[15]。

1.2.3  取样方法与测定项目  干旱胁迫第9天，两个品种的表型已经具有明显差异，即采收试验材料并测定生物量及根系形态。对中烟100和农大202胁迫处理后第0、3、6、9天叶片、侧根以及根尖进行DNA Ladder检测。对中烟100胁迫处理后第0、3、6、9天，农大202处理后第9天的叶片、侧根以及根尖进行TUNEL检测，分析各部位的PCD特征随干旱胁迫时间变化规律及两种耐旱性品种间的差异。

生物量测定：采样分地上部和根系，于105 ℃烘箱中烘24 h至恒质量后称量。

总根长、根系总体积和根系平均直径的测定：根系形态参数采用LA1600+根系扫描仪成像。测定总根长，根系总体积和根系平均直径。

DNA Ladder检测：检测参照卫星[17]的方法。

TUNEL（荧光）检测：参照宁顺斌等[18]的方法，略有改动，用DAPI染液替代PI染液，蓝光激发波长330～380 nm，发射波长420 nm，绿色荧光激发光波长465～495 nm，发射波长515～555 nm。

2  结  果

2.1  干旱胁迫对耐旱性不同的烟草品种苗期生长的影响

2.1.1  生物量  如表1所示，胁迫第9天，两个烟草品种的生长有明显差异。与对照相比，农大202地上部的生物量下降9.6%，无显著差异，而根系生物量下降12.9%，差异达到显著水平;而中烟100的地上部的生物量和根系生物量分别下降71.4%和67.0%，差异均达到极显著水平。

2.1.2  根系形态  由表1可以看出，胁迫第9天，农大202和中烟100的总根长均较对照低，中烟100较对照低60.3%，差异达到极显著水平，而农大202低12.2%，差异未到达显著水平。对于根系平均直径来说，中烟100较对照低16.6%，差异达到极显著水平，而农大202无显著差异。与对照相比，中烟100和农大202的根系体积均降低，农大202降低16.9%，差异达显著水平，而中烟100降低73.3%，差异达到极显著水平。且在相同处理下，农大202的根体积均高于中烟100。

2.2  干旱胁迫对烟草不同部位细胞程序化死亡的影响

2.2.1  DNA Ladder检测结果  由图1所示，在2.5%的PEG-6000处理前，中烟100以及农大202烟草的叶片、侧根以及根尖均未观察到明显的DNA片段化现象。随着时间变化，胁迫第3～9天，中烟100的侧根、根尖和叶片均出现了明显的DNA片段，说明干旱胁迫可诱导中烟100叶片、侧根、根尖部位的PCD。但在相同处理条件下，农大202烟草的叶片、侧根以及根尖部位未观察到明显的DNA片段化现象。

2.2.2  TUNEL检测结果  利用TUNEL（荧光）法对干旱胁迫处理的中烟100第0、3、6、9天以及农大202第9天的叶片、侧根和根尖进行显色及定位，结果如图2-5所示，中烟100各部位在第0天未有明显的绿色荧光，即各部位未发生PCD。在胁迫处理第3天，叶片、侧根以及根尖均呈TUNEL阳性反应，能观察到明显的绿色荧光，表明各部位均已经发生PCD，而根尖的PCD程度最高，叶片、侧根的PCD程度相近。胁迫处理第6天的检测结果与第3天类似，而在第9天，各部位发生PCD的强度已经没有明显的差别。

通过对材料进行定位，可以观察到，中烟100叶片在第3天和第6天，少量叶肉细胞出现绿色荧光现象，表明已开始发生PCD。在第9天，PCD发生程度最高，而且远离叶脉的细胞发生明显的PCD，靠近叶脉的细胞未发生明显的PCD。就侧根而言，侧根皮层细胞先发生PCD，最后逐渐向内部扩展，处理第9天，侧根内皮层、中柱鞘等细胞也开始出现明显的绿色荧光，并且可以看出细胞核变小等明显的PCD特征。而根尖细胞在胁迫处理第3天，已经发生明显的PCD。第6天时已经能观察到细胞外形皱折等现象，整个根尖的PCD程度不断加深。

由图6可知，农大202在处理9天后，叶片和侧根的皮层及内皮层中可以观察到轻度的绿色荧光，表明该部位有少量细胞发生了PCD。其根尖细胞能观察到明显的绿色荧光，并有细胞外形皱折等明显的PCD特征，表明根尖发生PCD程度较深。

3  讨  论

根系是植物吸收水分的主要器官，对外界胁迫十分敏感，感知干旱胁迫后，根系形态特征会发生相应的适应性变化，不同抗旱能力的植物会表现出不同的特征[19]。总根长可以反映根系的数量变化，而根体积是体现植物根系空间分布的指标之一[20]。有研究证明，干旱胁迫可以降低冬小麦幼苗的总根数、根系总长、根系体积和根系干质量，限制根系的生长[21]。本研究结果表明，不耐旱烟草品种中烟100在干旱胁迫处理后，总根长、根系平均直径、根系体积下降幅度大，最终影响地上部生长;而耐旱品种农大202在胁迫条件下，总根长和根系平均直径变化不明显，根系总体积下降幅度较低，能维持与对照处理相当的地上部生物量。

细胞发生PCD是抵御干旱的一种结果，是植物应对逆境的一种响应[22]。植物在干旱胁迫初期，基因会调控一部分细胞发生PCD，随着逆境时间的增长，植物细胞代谢紊乱，进而影响表型变化。植物细胞发生PCD后引起的生理和代谢变化有很多，干旱胁迫与PCD的发生有密切的联系。有学者[10]通过研究半夏倒苗现象发现干旱处理2 d细胞就开始发生PCD，随着干旱胁迫时间的延长，半夏茎的叶绿素含量及水势不断下降，相对电导率、可溶性糖和MDA的含量则不断升高，进而诱导半夏倒苗。另外，根据胡庆辉[23]的研究，干旱胁迫下，SOD、CAT活性均呈先上升再下降的趋势，POD活性和丙二醛含量逐漸增加，在干旱胁迫初期，保护酶SOD、POD和CAT活性升高，能及时清除过量的ROS，使胁迫的伤害保持在可控范围内。但是随着胁迫时间的增长，体内活性氧过多累积，超出保护性酶的清除能力，氧化平衡遭破坏，CAT、SOD活性均出现下降，特别是CAT活性降幅较大，膜脂过氧化损伤严重，膜系统受到损伤，使H2O2等凋亡诱导因子大量积累，促使叶肉细胞程序性死亡的发生。

只有当存在一定比例的凋亡细胞的时候，才能检测到“DNA Ladder”，但是一般情况下可将“DNA Ladder”的形成认为是判断凋亡发生的一个重要而且典型的指标[24]。而TUNEL法是一种灵敏度较高的植物PCD检测方法[25]，不仅特异性强，灵敏度高，还可以对PCD细胞进行定性与定量分析，甚至能检出早期未发生典型变化的PCD细胞[26]。所以本研究综合这两种PCD检测方法进行检测。

从本研究结果来看，烟草不同部位对干旱胁迫诱导的PCD的感知与响应并不同步。通过对不同处理时间的中烟100各部位中进行TUNEL检测，发现胁迫处理第3天，根尖PCD的响应强度明显高于其他两个部位。卫星[17]检测了水曲柳不同级侧根的根皮层薄壁细胞和根尖细胞的PCD特征，发现不同级侧根的PCD特征是有差异的，这也从侧面反映出了植物干旱胁迫时不同部位所发生PCD的响应是不同的。从DNA Ladder的结果来看，在胁迫处理3天，侧根、叶片和根尖均已出现明显的DNA条带，表明中烟100第3天已开始出现PCD，从TUNEL法的检测结果也印证了此结果。

另外，通过对材料进行TUNEL（荧光）检测，发现不耐旱性品种中烟100不同部位发生PCD的细胞是有规律的。干旱胁迫处理后，远离叶脉的细胞先发生PCD，而叶脉附近细胞的PCD现象不明显。就侧根而言，侧根皮层细胞更容易诱导成PCD，最后逐渐向内部扩展。对烟草叶片的PCD检测结果与CAO[27]等的报道相一致，其中的原因可能是正常的叶脉有利于细胞死亡后营养物质的运出，这可能是植物体的一种自我保护机制。SCHIEFIELBEIN[28]发现，为保护根尖生长，根冠细胞和皮层细胞可能接受某些“信号”来诱导PCD的发生。这与本研究中观察到的干旱胁迫早期，侧根皮层细胞先发生PCD的结果相一致，其他学者[29]也有类似发现。本研究观察到了根尖细胞在干旱胁迫后细胞外形皱折等现象，这与MATSUMOTO[30]描述的根尖细胞在胁迫后发生PCD的特征相同。ZHAN[31]发现铝胁迫下花生根尖分生组织区附近细胞更易诱发PCD，这与本研究中所观察到的结果相一致，这可能是因为在不同胁迫下，植物具有相同的信号传导途径来诱导PCD。从不同部位呈现的细胞程序化死亡特征的发生程度来看，控制这些细胞的死亡程序也应是不同的，很有可能是因为胁迫下不同部位信号转导机制不同。

在胁迫处理第9天，农大202各部位的DNA Ladder检测结果与TUNEL检测结果相矛盾，这是因为DNA条带的形成需要较多发生PCD的细胞，而TUNEL法灵敏度较高。而中烟100在水分胁迫处理后形成明显的DNA片段，各部位TUNEL荧光强度很高，可以看出耐旱性越弱，其PCD响应较快，并且响应强度较高。此外，胁迫第9天，农大202的根尖也有明显的绿色荧光现象，而侧根和叶片未能看到绿色荧光，这也从侧面反映出根尖在干旱胁迫下响应较快。

4  结  论

（1）在干旱胁迫早期，相对于不耐旱品种，耐旱品种总根长和根系平均直径下降不明显，发生PCD较迟，侧根、根尖和叶片PCD程度也较低。耐旱烟草品种在应对逆境时，PCD响应较慢的原因需要更深入的研究。

（2）根尖细胞PCD发生程度强于侧根与叶片，而随处理时间增长各部位PCD的发生程度已无明显差别。就不同部位的细胞而言，侧根皮层细胞以及远离叶脉的细胞发生PCD的时间较早。烟草不同部位细胞是如何感知并迅速产生信号物质向上传递来影响细胞发生PCD的机制需要进一步研究。

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