李 豪 吴嘉南 陈启和

（浙江大学食品科学与营养系 杭州 310058）

桦褐孔菌（Inonotus obliquus），亦称白桦茸，是一种生长在白桦树上的药用真菌，属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属。主要分布于俄罗斯、芬兰等北纬40°～50°的地区和我国的黑龙江大兴安岭、吉林长白山一带[1]。从16世纪以来，俄罗斯、波兰、芬兰等国家的民间就广泛使用桦褐孔菌来治疗各种疑难杂症，如各种癌症、心脏病和糖尿病等[2]。

桦褐孔菌含有多糖、三萜等多种化合物。其中的三萜类化合物是由数个异戊二烯去掉羟基后首尾相连构成的物质。天然的三萜类化合物的前体主要是鲨烯，已发现约200多种结构[3]。三萜的药理研究表明：三萜具有抗癌，抗炎，抗病毒，免疫调节保肝等多种活性[4]。白桦脂酸（Betulinic acid，BA），又名桦木酸，是三萜中非常重要的一种。近年来的研究表明，白桦脂酸具有诸多的生物活性，如抗肿瘤、抗 HIV[5]、抗炎[6]、抗菌、抗疟疾等[7]。大量试验表明白桦脂酸具有广泛的抗肿瘤活性，其能诱导多种肿瘤细胞凋亡，包括白血病细胞[8]、脑瘤[9]、神经外胚层瘤[10]、前列腺癌[11]、卵巢癌[12]、乳腺癌[13]、肺癌、结肠癌[14]以及宫颈癌[15]等细胞。白桦脂酸可以选择性地杀死人类癌细胞而不杀伤健康细胞[16]，同时还具有作用机制特异、分子质量小、低毒性等优点，有广泛的应用开发前景，是一类很有潜力的药物先导化合物。

目前，从高等真菌中直接提取三萜，已报道的有从灵芝、樟芝[17]中提取，也有报道从桦褐孔菌[18]中提取，而从高等真菌中提取白桦脂酸鲜有报道，已知的仅有通过黄绿蜜环菌进行生物转化[19]。目前对桦褐孔菌的液体深层发酵主要集中在生物量、多糖和多酚的测定，对三萜及白桦脂酸的研究报道较少。之前从高等真菌中得到的三萜和白桦脂酸的产量非常低，希望找到一种更为高效的提高三萜和白桦脂酸产量的方法。

最近的研究表明，法尼醇作为一种群体感知分子，可以通过促进多糖生物合成和调节菌丝体形态来显著增加云芝中的胞外多糖产量[20]。然而，目前对于法尼醇的研究主要集中在白色念珠菌[21]，对桦褐孔菌发酵过程的研究目前还没有报道。本试验将主要探讨法尼醇对桦褐孔菌发酵过程中生物量、三萜和白桦脂酸产量的影响。

1 材料和方法

1.1 菌种、试剂

桦褐孔菌 （Inonotus obliquus） 菌株 （编号CFCC 83414），中国林业微生物菌种保藏管理中心。

白桦脂酸，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯葡萄糖浸出液 （PDB），杭州微生物试剂有限公司；法尼醇（95%），Aladdin公司；香草醛（99%），Aladdin公司；DMSO，Sigma-Aldrich公司；乙酸乙酯、95%乙醇、正丁醇、冰醋酸、高氯酸（均为分析纯）；乙腈、甲醇（均为色谱纯）；麦麸，农贸市场；甲酸（98%，色谱纯），Aladdin公司。

1.2 仪器与设备

Thermo Fisher Multiskan FC酶标仪，美国；JY96-IIN超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；离心机（DD-5M），湘仪离心机仪器有限公司；超声波清洗器（JP-040S），深圳市洁盟清洗设备有限公司；恒温摇床，上海知楚仪器有限公司；超净工作台（SJ-CJ-2FDQ），苏州苏洁净化设备公司；高效液相色谱（Agilent1100），安捷伦科技有限公司。旋转蒸发仪，邦西仪器科技有限公司；冻干机，美国Labconco。

1.3 方法

1.3.1 培养基的制备

1.3.1.1 固体培养基 将麸皮按照质量分数5%加入水中，熬制0.5 h后用8层纱布过滤除去大颗粒，得到麸皮水浸提液；然后，加入PDA合成培养基（市售），混合均匀后，将其煮沸后分装在玻璃管中，每管10 mL，之后在121℃下灭菌20 min。灭菌后摆斜面至斜面凝固。

1.3.1.2 液体培养基 将麸皮按照5%（以水的体积计）的比例加入水中，并且熬制半个小时后用8层纱布过滤除去大颗粒，得到麸皮水浸提液；然后加入PDB合成培养基（市售），混合均匀后，分装在500 mL锥形瓶中，每瓶分装100 mL，在121℃下灭菌20 min。

1.3.2 菌种的活化与保藏 将桦褐孔菌CFCC 83414接种到斜面上，在25℃培养箱中培养15 d左右，待其长满整个斜面。每个月更新1次斜面。

1.3.3 接种和发酵 每个摇瓶接种1块1 cm2的桦褐孔菌。在25℃温度下培养，先静置2～3 d，然后以100 r/min的转速培养2～3 d，之后以180 r/min的转速培养。

1.3.4 法尼醇的加入 法尼醇配制：先配制成1 mol/L的储备液，然后稀释成50 mmol/L的工作浓度。称取0.22236 g法尼醇，溶于1 mL的DMSO中，得到1 mol/L的储备液，用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，然后稀释20倍，得到50 mmol/L的工作液。在发酵液中分别添加0.1，0.2，0.3，0.6 mL的50 mmol/L的工作液，使发酵液中法尼醇的终浓度为 50，100，150，300 μmol/L。同时加入 1.2%的DMSO作为空白对照组。法尼醇或1.2%的DMSO均在正常发酵过程中的第6天加入。

1.3.5 三萜的测定 胞内 （Intracellular triterpenoids，IT）三萜：桦褐孔菌菌丝经去离子水洗涤、离心、收集，冻干至恒重，取适量菌丝按1g/50 mL，每个约0.4 g，加入体积分数95%的乙醇，用细胞破碎仪破碎，于60℃，400 W下提取1 h，并重复1次，合并上清液，定容后待测。其三萜含量（mg/g）采用香草醛-高氯酸法。

总 IT 含量（mg/100 mL）=IT 含量（mg/g）×菌丝生物量（g/100 mL）

胞外三萜 （Extracellular triterpenoids，ET）测定：将各菌株发酵液3 500 r/min离心20 min，收集上清液并定容100 mL（记为A溶液）。取一定体积A溶液 （V1mL），用3倍体积的水饱和正丁醇萃取2次，合并萃取液并减压浓缩蒸干，用甲醇复溶并定容 5 mL，记为溶液B，其ET含量（mg/mL）采用香草醒－高氯酸方法测定。

总ET含量 （mg/100 mL）=B溶液中ET含量（mg/mL）×100 mL/V1

香草醛-高氯酸测定方法：取待测样品溶液或样品稀释液0.1 mL于试管中，70℃加热挥干溶剂，加5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.5 mL，混匀后于60℃水浴中20 min，取出，置于冷水中15 min，最后加入冰醋酸5 mL，混匀，吸取200 μL于波长550 nm处测定吸光值。每个设3个复孔。

三萜标准曲线的制定 （以白桦脂醇为对照）：称5 mg白桦脂醇于离心管中，加10 mL无水乙醇，配成500 μg/mL的储备液。用无水乙醇稀释成200 μg/mL的工作液。取 200 μg/mL的白桦脂醇工作 液 0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL 于 试 管 中（对应的质量浓度 10，20，40，60，80，100，120 μg/mL），之后按照香草醛-冰醋酸法测量。

1.3.6 白桦脂酸含量的测定 胞内BA：将得到的菌体超声破碎仪破碎5次，每次1 min，加入等量的乙酸乙酯萃取，60℃，400 W下提取1 h，萃取2次。合并上层有机相，3 500 r/min离心20 min，旋转蒸发浓缩，然后用色谱纯的甲醇溶解，0.22 μm的有机相微孔滤膜过滤，RP-HPLC法检测。

胞外 BA：取 1.3.5 节中一定的体积 C（V3），加入等量的乙酸乙酯萃取，60℃，400 W下提取1 h。萃取2次，合并上层有机相，3 500 r/min离心20 min，旋转蒸发浓缩，然后用色谱纯的甲醇溶解，0.22 μm的有机相微孔滤膜过滤，RP-HPLC法检测。

采用反相液相色谱法（RP-HPLC），色谱检测条件：色谱柱 Cosmosil （4.6 ID×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈/0.1%甲酸（体积比91/9）；流速1.0 mL/min；检测波长210 nm；柱温 35℃；进样量20 μL；跑样时间25 min，梯度洗脱。

绘制标准曲线：取1 mL标准品进样，在色谱检测条件下测定对应的峰面积值（A），以峰面积值A为纵坐标，白桦脂酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线。

试验组在发酵中期时加入法尼醇，对照组加入同样浓度的DMSO。

2 试验结果

2.1 法尼醇对桦褐孔菌菌体生物量的影响

法尼醇对桦褐孔菌生物量的影响如图1所示。对照组菌体生物量最大，当法尼醇的添加量从50 μmol/L 递增到 300 μmol/L 时，菌体的生物量呈递减趋势。150 μmol/L和300 μmol/L两个浓度的法尼醇对菌丝的生物量的抑制效果相当。加入法尼醇可抑制桦褐孔菌的生长，并呈浓度依赖关系。

2.2 法尼醇对胞内三萜的影响

三萜是桦褐孔菌非常重要的一类次生代谢产物。法尼醇的浓度对胞内三萜的影响如图2所示。100 μmol/L和150 μmol/L法尼醇的添加量对应的菌体中三萜的含量分别为14.95 mg/g和15.55 mg/g，与对照相比，各提高了11.2%和16.0%。50 μmol/L和 300 μmol/L的添加量对菌体中三萜含量的影响不大。从图2可看出，随着法尼醇浓度的增大，胞内三萜呈现先上升后下降的趋势，150 μmol/L的法尼醇对菌体中三萜的促进作用最大。

图1 法尼醇浓度对菌体生物量的影响Fig.1 Effect of the concentration of farnesol on the mycelia’s biomass

图2 法尼醇浓度对胞内三萜的影响Fig.2 Effect of the concentration of farnesol on intercellular triterpenoids

2.3 法尼醇对胞外三萜的影响

桦褐孔菌胞外的三萜含量研究较少。图3为法尼醇浓度对胞外总三萜含量的影响。随着法尼醇浓度的增大，胞外三萜呈现先上升后下降的趋势，50 μmol/L的法尼醇对胞外三萜的促进作用达到最大值，与对照相比，含量提高了约1倍。结合图2 可知，添加 100 μmol/L和 150 μmol/L 法尼醇时，三萜更多地保存在了胞内，胞外三萜的含量不是很高。

2.4 法尼醇对胞内BA的影响

法尼醇浓度对菌体中BA含量的影响如图4所示。法尼醇的添加量较低时，对菌体中BA含量的提高作用不明显。当法尼醇的添加量增到150 μmol/L时，菌体中BA的含量急剧增加，与对照相

图3 法尼醇浓度对胞外三萜的影响Fig.3 Effect of the concentration of farnesol on extracellular triterpenoids

2.5 法尼醇对胞外BA的影响

图5所示为法尼醇的浓度对发酵液中BA浓度的影响。随着法尼醇浓度的增大，发酵液中BA的浓度呈先上升后下降的趋势。在法尼醇添加量为 100 μmol/L，发酵液中 BA的质量浓度最大，0.1395 μg/mL，与对照 0.0351 μg/mL 相比，提高了3倍。在法尼醇添加量为50，150，300 μmol/L时，发酵液中BA的含量也有所提高，分别提高了21.6%，70.6%，14.8%。比，提高了4倍。当法尼醇的添加量为300 μmol/L时，菌体中BA的含量为41.0 μg/g，是对照的10倍。菌体中BA的含量随法尼醇添加量的增加而增加。

图4 法尼醇浓度对菌体中BA含量的影响Fig.4 Effect of the concentration of farnesol on the content of BA in mycelia

图5 法尼醇浓度对发酵液中BA浓度的影响Fig.5 Effect of the concentration of farnesol on the concentration of BA in fermentation broth

3 讨论

本研究结果表明，在桦褐孔菌发酵过程中，随着法尼醇添加量的增加，菌体的生物量逐渐下降，即法尼醇的加入抑制菌体的生长。菌体中的三萜，发酵液中的三萜和BA随着法尼醇添加量的增加，都呈先增后降的趋势，且对于这3个指标，法尼醇的最佳添加量分别为 150，50，100 μmol/L。而菌体中BA的含量随着法尼醇添加量的增加而增加。