王天泽 杜文斌 谭 佳 赵 健 谢建春

（食品营养与人类健康北京高精尖创新中心 食品质量与安全北京实验室 北京工商大学 北京 100048）

热反应肉味香精是以蛋白酶解物为主要原料，基于肉香风味形成原理而制造的食品添加剂，已广泛用于方便面、火腿肠、膨化食品、速冻水饺等多种食品的增香调味。蛋白酶解物中含有游离氨基酸、多肽、蛋白质及还原糖等肉香前体物，以酶解物为原料制备的热反应肉味香精，不仅具有肉的香气，还具有肉汤的滋味[1-2]。

迄今，有关美拉德反应和脂质氧化在热反应肉味香精领域的研究主要集中在对肉香气形成贡献上[3-8]，如曹长春等[3]研究了“半胱氨酸-木糖”产生的香气物质，其检测到2-甲基-3-呋喃硫醇和2-糠硫醇的含量最高；Hou等[4]研究了复杂美拉德反应体系“半胱氨酸-木糖-甘氨酸”中不同初期美拉德反应中间体对肉香味形成的贡献大小，Yang等[6]研究了添加氧化及未氧化鸡脂对“半胱氨酸-葡萄糖”热反应产生肉香气的影响，靳林溪等[7]分析鉴定了“氧化鸡脂-半胱氨酸”反应体系产生的香气物质。有关美拉德反应对热反应产物滋味影响研究近年也开始被研究者关注[9-12]，如Liu等[9]研究“鸡肉肽-木糖”反应，发现低温、较长时间的美拉德反应有利于反应产物具有肉汤的鲜味和醇厚感。Lan等[10]研究“大豆肽-木糖”美拉德反应，发现肽在热反应中可发生自身降解反应和美拉德交联反应，而发生美拉德交联反应后，小于1 000 u肽组分中苦味氨基酸、苦味肽含量降低，1 000～5 000 u肽的含量增加。但有关脂质氧化反应对热反应产物滋味影响的研究却鲜有报道。Azad Shah等[13]曾将青鱼片酶解物与脂肪酸的反应产物加入日本清面汤中，发现该反应产物可显著提升面汤的饱满感、醇厚味、连续性。

本文以猪肉的酶解物为原料，通过设计“酶解物”（空白）、“木糖-酶解物”、“氧化猪脂-酶解物”、“木糖-氧化猪脂-酶解物”4个热反应体系，研究木糖、氧化猪脂添加于酶解物中对热反应产物滋味的影响，并尝试对热反应产物呈味肽组分进行分离鉴定，以探讨不同反应体系滋味产生差异的原因。本研究结果可为热反应肉味香精制备提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪后腿肉，北京美廉美超市；氧化猪脂（P.V.=223 meq/kg；A.V.=0.65 mg KOH/kg），按照文献[14]制备；复合蛋白酶、风味蛋白酶，诺维信公司；三氟乙酸（色谱纯）、木糖（分析纯），北京百灵威科技有限公司；乙腈（色谱纯），飞世尔实验器材有限公司；正己烷（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；葡聚糖凝胶Sephadex G-15，美国GE Healthcare公司。

1.2 仪器与设备

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，河南省予华仪器有限公司；PHSJ-3F实验室pH计，上海仪电有限公司；3-30K高速离心机，美国Sigma公司；ALPHA 2-4 LSC冷冻干燥机，德国Christ公司；MASTERFLEX蠕动泵，科尔帕默仪器有限公司；Pellicon 2 Mini超滤装置及 1，3，5 ku 再生纤维素超滤膜，美国Millipore公司；MD-55自动液相色谱分离系统，上海青浦沪西仪器厂；LC1200型高效液相色谱仪，美国Agilent公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酶解液制备 肉去除可见脂肪，于90℃水漂烫3 min，绞成肉糜。将一定量的肉糜、水加入到烧瓶中（肉水比1∶1，w/w），加入0.4%的复合蛋白酶，于55℃水浴下酶解3 h；再加入0.3%的风味蛋白酶，酶解1 h；升温至85℃，灭酶10 min。

酶解液15 000 r/min离心10 min，取上清液，冻干，干粉加入正己烷除脂，待用。

1.3.2 热反应 取0.5 g除脂冻干粉，加水5 mL成酶解液，置于15 mL耐压管中。按表1，4个反应体系 “单纯酶解液”、“酶解液+氧化猪脂”、“酶解液+木糖”、“酶解液+氧化猪脂+木糖”，120℃反应1 h，感官评价。

表1 热反应所用原料Table1 Materials used in the thermal reactions

1.3.3 吸光度、颜色、pH值的测定 反应液使用pH计测定。反应液先经0.45 μm膜过滤后，用超纯水稀释到适当浓度，在波长420 nm下测定吸光度值，结果=测定值×稀释倍数。

色度测定参照SB/T 10323-1999进行[15]。称取碘1.000 g、碘化钾2 g，先将碘化钾用少量蒸馏水溶解，再加入精确称取的碘，全部溶解后移入100 mL容量瓶内，定容后得1%碘液；1%碘液再进一步稀释后得到系列不同浓度的标准色液。将反应液与系列标准色液比较，其中与标准色液颜色最一致的碘液浓度，记录为该反应液的色度值。

1.3.4 超滤分离 热反应液先经0.45 μm膜过滤。使用Millipore Pellicon 2 Mini型超滤装置和截留分子质量（MW）为1，3，5 ku的纤维素超滤膜超滤。氮气压力0.02 MPa。先使用5 ku的膜，透过液再依次使用3，1 ku的膜进行分级分离，得到4个组分，分别为 MW＞5 ku、MW 3～5 ku、MW 1～3 ku和MW＜1 ku。各组分冷冻干燥，称重，感官评价，备用。

1.3.5 葡聚糖凝胶色谱分离 对超滤所得MW＜1ku组分进行分离。采用自动液相色谱系统进行。Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱（玻璃柱，3.0 cm×60 cm），超纯水洗脱，流速 1.0 mL/min，上样 5 mL，上样液质量浓度100 mg/mL。紫外检测波长220 nm。根据谱峰收集组分，冻干、称量、感官评价。

1.3.6 反相高效液相色谱分离 样品为葡萄糖凝胶色谱柱分离后的呈味组分。先采用分析型色谱柱 Zorbax 300SB-C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）建立了分析方法：流动相组成A水/三氟乙酸（1∶0.001，V/V），B 乙腈/三氟乙酸（1 ∶0.001，V/V）；流速 1 mL/min；梯度洗脱，0～14 min，3→23%B；14～16 min，23→75%B；16～28 min，75→95%B。柱温30℃；检测波长为220 nm。然后在相同的色谱条件下，采用 Zorbax 300SB-C18（9.4 mm×250 mm，5 μm）色谱柱制备性分离收集，样品质量浓度10 mg/mL，进样50 μL，重复进样，自动馏分收集各组分、冻干、称量、感官评价。

1.3.7 感官评价 样品温度60℃，样品质量浓度10 mg/mL左右。品尝醇厚感时，样品与肉汤按1∶1（V/V）比例混合后进行品尝。肉汤采用市场上购买的浓汤宝配制。

评价小组包括5名人员，年龄在21～26周岁之间，其中男性2名，女性3名。描述词包括鲜味、肉味、醇厚感、持续性。味的强度通过排序法给出，按强度递增顺序用无味、几乎无味、弱、一般、较强、强等词汇，表示样品间的相对强度大小。

1.3.8 基质辅助激光解析电离质谱（MALDI-TOFMS）分析 委托北京大学分析中心进行。5800型MALDI-TOF-MS质谱仪 （美国AB Sciex公司）。样品为反相高效液相色谱分离收集后的组分，溶剂为超纯水。使用60%的乙腈水溶液配制饱和的α-氰基-4-羟基肉桂酸（CCA）溶液作为基质，将基质溶液与样品1∶1混合，取1 μL点在MALDI靶板上，在室温下自然干燥。

一级质谱分析：激光光源为固态激光光源，波长349 nm，脉冲加速电压7 kV，采用正离子反射模式采集数据。采集相对分子质量范围：100～1 000 u。二级质谱分析：选择一级谱中目标母离子峰进行二级质谱分析（MS/MS），加速电压2 kV，采用CID碰撞裂解母离子，获取每个母离子的离子碎片。

2 结果与讨论

2.1 热反应产物基本特性比较

4个体系热反应产物的吸光度、色度值、及pH值，见表2。

表2 热反应产物基本特性比较Table2 Basic characteristics determined for the four thermal reaction products

木糖可与酶解液中的含氨基化合物发生美拉德反应，而氧化脂肪因含有一定量的醛、酮、氢过氧化物等脂质氧化产物[16-18]，其也与酶解液中的含氨基化合物发生反应[19]。总之，4个反应体系中主要反应均为“羰-胺”反应，反应产物的褐变程度可用420 nm吸光值或反应液的色度表示[20-23]，420 nm吸光值与形成的褐变产物（类黑精）的含量有关[5，24]，而色度与肉眼观察的反应液颜色有关，二者往往具有一致性的变化趋势。pH与反应过程中游离氨基酸、多肽、蛋白质等化合物中氨基的消耗及反应产物中有机酸的形成有关，一般而言随着反应进行pH呈下降趋势[25-27]。

由表2可知，与酶解液自身热反应相比，加入氧化脂肪或木糖后，反应产物的420 nm吸光值及色度值均升高，pH均降低，但加入木糖后的变化幅度大，而加入氧化脂肪的变化幅度较小。同时加入木糖和氧化猪脂的变化与单独加入木糖时差距不大。这些结果表明，酶解液中加入木糖发生的褐变反应程度远大于加入氧化猪脂，氧化猪脂对反应液褐变产生的影响较小。

2.2 热反应产物滋味

4个体系热反应产物进行滋味评价，结果见表3。

表3 热反应产物的滋味特性Table3 Taste properties of the four thermal reaction products

由表3可知，与“酶解液”体系相比，加入氧化猪脂后，热反应产物的“鲜味”提升，“肉味”轻微提升，“醇厚感”较大提升，“持续性”显著提升；加入木糖后，热反应产物的“鲜味”和“肉味”均显著提升，但“醇厚感”和“持续性”较小提升。氧化猪脂和木糖都加入时，热反应产物 “鲜味”、“醇厚感”和“持续性”显著提升，“肉味”较大提升。进一步比较可得出，木糖的加入更多地增强热反应产物的“鲜味”、“肉味”，而氧化猪脂的加入更多地增强“醇厚味”、“持续性”。

2.3 超滤分离及组分滋味评价

“酶解液+氧化猪脂”、“酶解液+木糖”、“酶解液+氧化猪脂+木糖”热反应产物超滤分离所得＞5 ku、3～5 ku、1～3 kua和＜1 ku 组分所占百分比及滋味评价结果见表4。

表4 超滤分离所得不同分子质量范围组分占百分比（%）和滋味特性Table4 Percentages and taste properties of the ultra filtration fractions in different MW ranges

由表4可以看出，3个体系均为＜1 ku的组分所占百分比最多，其次是＞5 ku的组分，3～5 ku和1～3 ku组分所占百分比较少。3个体系均是＞5 ku、3～5 ku组分无味；1～3 ku的组分几乎无味；而主要呈味的为＜1 ku的组分。其中“酶解液+氧化猪脂”体系热反应产物＜1 ku的组分的醇厚感、持续性均强，“酶解液+木糖”体系热反应产物＜1 ku的组分的鲜味强，“酶解液+氧化猪脂+木糖”体系的＜1 ku的组分鲜味强、醇厚感较强、持续性强。这与2.2节热反应产物的滋味比较结果相一致。加入糖后的鲜味增强，很可能与形成交联性的美拉德反应产物有关[12]。

2.4 凝胶色谱分离

对超滤所得的＜1 ku的呈味组分进行葡聚糖凝胶色谱柱分离，色谱图如图1所示，收集的组分评价结果见表5。

由图1可知，样品（“酶解液+氧化猪脂”体系）被分离洗脱出6个峰，在180～390 min之间，主要的峰在180 min以后被洗脱出来；样品（“酶解液+木糖”体系）被分离洗脱出4个峰，在180～360 min之间，主要峰在180 min以后被洗脱出来；样品（“酶解液+氧化猪脂+木糖”体系）被分离洗脱出5个峰，在100～360 min之间，主要的峰在120 min以后被洗脱出来。

表5为图1中葡聚糖凝胶分离所得各组分峰的感官评价结果。根据表5可知，“酶解液+氧化猪脂”体系中，分离所得的峰G2醇厚感较强、持续性强；“酶解液+木糖”体系中，分离所得的峰G1鲜味最强；“酶解液+氧化猪脂+木糖”体系中，分离所得的峰G3鲜味较强，醇厚感最强，持续性强。

2.5 反相高效液相色谱分离

分别对“酶解液+氧化猪脂”、“酶解液+木糖”、“酶解液+氧化猪脂+木糖”体系中的主要呈味峰G2、G1、G3进行反相高效液相色谱分离，所得色谱图如图2所示。

由图2可以看出，谱峰H1～H6和H8为3个体系反应产物中的共有组分，除了“酶解液+木糖”体系外，“酶解液+氧化猪脂”和 “酶解液+氧化猪脂+木糖”体系均存在峰H7和H9，因此推测峰H7和H9的组分的出现与反应体系组成中加入氧化猪脂有关。

图1 3个体系超滤所得＜1ku组分的凝胶分离色谱图Fig.1 Chromatograms of Sephadex G-15 separation of the＜1ku taste-active fractions from the three reaction products

表5 葡聚糖凝胶G-15分离所得各组分的滋味特性Table5 Taste properties of the fractions collected in the Sephadex G-15 chromatographic separation

图2 葡聚糖凝胶G-15分离所得呈味组分的反相高效液相色谱（分析型色谱柱）分离图Fig.2 RP-HPLC chromatograms in the separation of the taste-active fractions collected from the Sephadex G-15 chromatographic separation

对H1～H9谱峰组分进行液相色谱制备性分离，所收集流分的滋味品评结果见表6。可知，峰H1-H6味道相似，主要呈鲜味、并带有酸味，但鲜味最强的为H1组分，其它组分的鲜味很弱。H8组分鲜味和醇厚感都有，且醇厚感强、持续性较强。由于H1～H6和H8为3个体系反应产物中的共有组分，从滋味特征推测H1～H6应为来源于酶解物中的呈味多肽，而H8可能为美拉德肽[12]（注：酶解液中含有少量还原糖，因此“酶解液+氧化猪脂”体系会检测到H8组分）。

H7和H9这两个与反应体系中氧化猪脂的加入有关的组分中，前者几乎无味、且持续性弱；而后者突出的味感为醇厚味、并具有持续性，推测后者很可能为小分子羰基类脂肪氧化成分修饰的肽组分。

表6 反相高效液相色谱分离所得组分的滋味特性Table6 Taste properties of the fractions collected in the RP-HPLC chromatographic separation

2.6 呈味组分的结构鉴定

尽管进行了超滤、葡聚糖凝胶色谱、反相高效液相色谱的多级分离，但由于热反应产物组分复杂，最后收集制备的样品，反过来再用反相液相色谱进行分析，发现仍然不纯，但H1、H9号峰样品相对较纯。为此对这两样品进行MALDI-TOF一级质谱分析，然后再选择一级质谱图中强度高的峰进行二级质谱分析，结果见图3。

图3 HPLC分离收集H1、H9组分的MALDI-TOF一级质谱图及其主要质谱峰m/z448.2859、762.4446和806.4725对应的二级质谱图Fig.3 MALDI-TOF mass spectra in analysis of fractions H1 and H9 and their corresponding MS/MS spectra for m/z 448.2859，762.4446 and 806.4725

由图3可知，H1号峰样品一级质谱中相对强的质谱峰为m/z448.2859，H9号峰样品一级质谱中相对强的质谱峰为m/z762.4446，806.4725。对这3个质量数进行二级碰撞，根据所得二级质谱碎片，并结合肽类化合物的质谱裂分规律[28-29]，推测出m/z448.2859可能为五肽丙氨酸-甘氨酸-谷氨酸-苏氨酸-丙氨酸，由于组成该肽的氨基酸均为鲜甜味氨基酸，可知这很可能是H1号峰具有较强的鲜味的原因。H9组分中m/z762.4446、m/z806.4725推测为脂质修饰的肽，分别为己醛修饰的甘氨酸-谷氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-苏氨酸-天冬氨酸，及丙氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-赖氨酸 （2-己烯醛修饰）-甘氨酸-半胱氨酸-天冬酰胺。2-己烯醛与肽的结合方式很可能为肽链中赖氨酸或精氨酸上的残留氨基，通过迈克尔加成反应与2-己烯醛结合[30]。前期研究表明[16]，2-己烯醛和己醛是氧化脂肪中含有的主要具有较高反应活性的醛，而己醛和2-庚烯醛可与谷胱甘肽反应，生成不挥发性加合物[31]。另外，H9组分采用600 M核磁共振碳谱初步分析 （未提供数据），发现在δC 20～30处检测出峰簇，这可能也与H9的组分中含有脂质化碳链有关。可能因为肽被脂质化修饰后，亲脂性变强，从而对肉汤的滋味有增强醇厚感和持续性的效应，但这还有待于进一步研究。

3 结论

1）以猪肉酶解物为原料的热反应，热反应产物中主要呈味组分为＜1 ku肽组分。木糖的添加对褐变反应贡献远大于氧化猪脂，木糖的添加对于提升反应产物的鲜味、肉味等滋味特性具有主要贡献，而氧化猪脂的添加对于提升反应产物的醇厚感、持续性的滋味特性有主要贡献。

2）反应产物中＜1 ku呈味肽组分，经葡聚糖凝胶色谱、反相高效液相色谱分离收集，MALDITOF一级和二级质谱分析，鉴定出3个肽分别为丙氨酸-甘氨酸-谷氨酸-苏氨酸-丙氨酸、己醛修饰的甘氨酸-谷氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-苏氨酸-天冬氨酸、丙氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-赖氨酸（2-己烯醛修饰）-甘氨酸-半胱氨酸-天冬酰胺，其中丙氨酸-甘氨酸-谷氨酸-苏氨酸-丙氨酸肽可能对鲜味具有主要贡献，而己醛修饰的甘氨酸-谷氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-苏氨酸-天冬氨酸和丙氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-赖氨酸（2-己烯醛修饰）-甘氨酸-半胱氨酸-天冬酰胺两个脂质化修饰肽对增强醇厚感和持续性有贡献。