张锦丽，吴杭捷，郭 伟

(浙江省医疗健康集团杭州医院 重症监护室，浙江 杭州 310021)

重症肺炎是呼吸内科常见的社区获得性感染，病情严重，发展迅速，病程长[1]。重症肺炎患者死亡率较高，为20%～50%[2]。Th17/Treg动态平衡与炎症的发生发展有着密切联系[3-5]。microRNAs (miRNAs)是一种长度为21～24个核苷酸的小型非编码RNA[6]，miR-155在炎症介导的相关疾病中的作用被相继报道[7-8]。本研究检测重症肺炎患者miR-155水平，结合Th17/Treg动态平衡状态对miR-155保护肺组织的机制进行探讨。

1 材料和方法

1.1 一般资料 选取浙江省医疗健康集团杭州医院2018年3月—2019 年3月收治的重症肺炎患者32例，其中男18例，女14例，平均年龄(61.09±7.72)岁，均符合重症肺炎相关诊断标准[9]。以同期健康体检者32例为健康对照组，其中男17例，女15例，平均年龄(62.11±7.08)岁。2组研究对象平均年龄、性别比较，差异均无统计学意义 (P>0.05)。所选研究对象均签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 实验动物及材料 选取成年健康Sprague-Dawley(SD)大鼠39只，6～8周龄，体质量200～250 g，雌雄不限，购于北京华埠康生物技术有限公司[SCXK(京)2016-0275]。SPF系统内分笼饲养，12 h循环光照，室温(23.0±1.0)℃，湿度50%～60%，适应性喂养1周。miR-155模拟物(miR155-Mimics)购自广州锐博生物科技有限公司，FITC-Foxp3 (鼠8512477180 ，人71577640)、PE-Cy5.5-CD4 (鼠8511004181，人35004280)、PE-IL-17A (鼠8512717781，人12717842)、PE-CD25 (鼠51-0259- 41，人25-0259-42)、PE-Cy5 IgG1(共用PA5-75428)均购自eBioscience公司，IL-17A(鼠1311702， 人512315)、IL-6(鼠1310602， 人430501)、IL-10(鼠1311002， 人501420)等ELISA检测试剂盒购自达科为生物科技有限公司。

1.3 大鼠肺炎模型建立及给药方法 参照文献[10]，培养肺炎克雷伯菌(武汉淼灵生物科技有限公司)制备成混悬菌液备用。将大鼠按照随机数字法分成3组，每组13只，分别为对照组、模型组(重症肺炎模型)和miR-155组。模型组和miR-155组大鼠麻醉后，以仰卧姿态固定在操作台上，将舌头固定在口外，声门显露，插入气管约0.5 cm，拔出导丝。0.4 mL的肺炎克雷伯菌液(含菌量1.2×1010CFU/mL)经导管注射至大鼠气管，确保菌液全部进入。当大鼠出现呼吸急促、喘息、哮鸣音、躁动、口唇、耳紫绀等症状时为造模成功[11]。对照组腹腔注射等体积的无菌生理盐水。造模前24 h，miR-155组气管穿刺注入miR-155模拟物40 μg，对照组和模型组腹腔注射等量无菌生理盐水。造模成功后24 h，各组大鼠腹主动脉采血5 mL(1 mL抗凝全血，其余抗凝离心后取血清)，并剖开胸腔取肺组织，部分于4%多聚甲醛中固定，剩余组织冻存于液氮中。

1.4 miR-155检测 提取血清中总RNA，将RNA反转录为cDNA，通过qRT-PCR检测miR-155水平，上海生工生物工程(上海)股份有限公司协助完成引物设计和合成，严格按照SYBR Green PCR 混合试剂盒(德国Qiagen)说明书操作。miR-155正向和反向引物分别是：5’-UUAALUGGUAAUUGUCAUACGGGU-3’和5’-CCCUAUGACAAUUACCAUUAA UU-3’，内参为U6，采用2-△△ct法进行定量计算，实验重复3次。

1.5 Th17和Treg细胞比例测定 采用FC500 MCL流式细胞仪进行检测。分别采集重症肺炎组和健康对照组研究对象3 mL抗凝血，Ficoll 法分离出外周血单个核细胞，悬液于2个流式管中，第 1 管中加入 PERCP标记的CD4抗体，第2管中加入PERCP标记的CD4、FITC标记的CD25，室温避光孵育30 min，PBS洗涤离心后室温避光孵育IL-17A 破膜剂A液15 min，清洗。加入IL-17A 破膜剂B液及IL-17A 抗体，通过IgG1做同型对照，室温下避光孵育30 min，清洗重悬等待上机。以相同操作孵育Foxp3对应的抗体，上机设门后分别分析CD4-CD25-Foxp3-/CD4-(Th17细胞)和CD4+IL-17+/CD4+(Treg细胞)在外周血中的比例。另取大鼠肺组织的单个核细胞，调整至1×106个/mL，步骤同上。

1.6 ELISA IL-17A、IL-6、IL-10水平检测 采用ELISA法。取各组外周血3 mL，EDTA抗凝后3 000 r(有效离心半径10 cm)，4 ℃下离心10 min，取上层血清。加入不同浓度标准品(100 μL /孔)至相应孔中，封孔、室温下孵育120 min后洗板5次。加入生物素化抗体工作液(100 μL/孔)，密封室温孵育60 min，洗板。加入酶结合物工作液(100 μL /孔)，密封室温孵育20 min，洗板。100 μL /孔显色剂显色，密封室温孵育20 min。加入终止液混匀检测重症肺炎组、健康对照组和大鼠对照组、模型组、miR-155组血清中IL-17A、IL-6和IL-10水平。

1.7 HE染色及形态学分析 各组大鼠肺组织采用4%多聚甲醛溶液固定后脱水及石蜡包埋，制成厚度约为5 μm的组织切片，行常规HE染色，中性树胶封固，显微镜下观察。

1.8 统计学分析 采用SPSS 20.0统计软件，计量资料2组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重症肺炎患者血清中miR-155及炎症因子水平 重症肺炎组患者血清中miR-155水平低于健康对照组，IL-17A水平高于健康对照组，IL-10低于健康对照组，IL-6水平高于健康对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见封三图1。

2.2 重症肺炎患者外周血中Th17和Treg的比例 重症肺炎组患者外周血中Th17细胞比例高于健康对照组，Treg细胞比例低于健康对照组，Th17/Treg的比值高于健康对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见封三图2。

2.3 大鼠肺组织的HE染色结果 HE染色结果显示，正常组大鼠肺小叶结构清晰，肺泡腔结构完整，未见炎性细胞浸润和上皮黏膜脱落现象；模型组大鼠肺泡结构紊乱，可见炎性细胞浸润及出血症状；miR-155组大鼠炎性浸润减少；见封三图3。

2.4 大鼠外周血中Th17和Treg的比例 与正常组相比，模型组大鼠Treg细胞比例降低，Th17细胞比例上升，Th17/Treg的比值上升，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，miR-155组大鼠Treg细胞比例上升，Th17细胞比例下降，Th17/Treg的比值下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；见封三图4。

2.5 大鼠血清中miR-155及炎症因子水平 与正常组大鼠血清中miR-155的相对表达量(1.00±0.13)比较，模型组大鼠miR-155的相对表达量(0.42±0.09)下降，差异有统计学意义(t=6.42，P=0.003)；miR-155组大鼠miR-155的相对表达量(1.03±0.16)高于模型组，差异有统计学意义(t=7.07，P<0.001)。与正常组相比，模型组重症肺炎大鼠血清中IL-17A和IL-6水平上升， IL-10水平下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，miR-155组大鼠血清中IL-17A和IL-6水平下调，IL-10水平上调，差异均有统计学意义(P<0.05)；见封三图5。

3 讨论

病毒性肺炎和细菌性肺炎是导致儿童、老年人、免疫缺陷者和全世界共病者死亡的重要原因[12-13]。肺炎初次感染时，病毒或者细菌潜伏在患者体内多个器官中，尤其是肺部。当机体免疫功能受到抑制后，病毒或细菌将成瀑布式暴发，与机体免疫系统形成对抗[14-16]，最终发展成重症肺炎。重症肺炎作为一种急性呼吸道感染，是常见的高死亡率疾病之一[17]。目前可用于监测肺炎发展的特异性生物指标尚不完善，迫切需要检测方便和特异性高的生物指标来监测重症肺炎的发生发展，以提高重症肺炎的确诊率。

miRNAs可通过介导RNA裂解、抑制mRNA翻译或引起mRNA不稳定来调节基因表达。miR-155干扰免疫系统的B细胞、T细胞和树突状细胞功能，并在多种疾病中具有不同的表达模式[18]。本研究结果显示，miR-155在重症肺炎患者和大鼠模型血清中的相对表达量均明显下降，肺部损伤明显；当miR-155过表达时，重症肺炎大鼠肺部损伤减轻，炎性浸润减少，表明miR-155过表达对于重症肺炎大鼠的肺部有一定的保护功效。miR-155对人肺组织的保护作用，仍需进一步研究确定。

研究[19-20]显示，虽然具体触发重症肺炎的机制尚不明确，但是炎症反应在重症肺炎进展中的地位已明确。当初期潜伏的病毒或者细菌被激活后，宿主自身免疫调节开始发挥作用[16]，这时多种炎症因子成瀑布式暴发，最终由局部肺炎发展成全身炎症反应，甚至可导致肺部乃至多器官的衰竭。Th17/Treg失衡是炎症反应的重要特征之一，有研究[21]显示Th17/Treg平衡在肺炎患者中的重要性。本研究结果显示，重症肺炎患者和大鼠模型外周血中Th17细胞比例明显增加，Treg细胞比例明显降低。在宿主体内，当炎症发生时，Th17和Treg细胞显示出相反的变化趋势，一方面，Th17细胞主要作用是促进炎症反应，这一效应通过分泌大量的IL-17并聚集大量炎症细胞达成[22]，此时机体内的IL-6等其他炎性因子的表达也会增多；另一方面，Treg细胞的主要作用是负性调节免疫细胞，达到抑制T细胞增殖、活化的效应，防止自身免疫疾病的发生，这一效应主要通过分泌IL-10等炎性细胞因子而发挥免疫抑制功能。本研究结果显示，重症肺炎患者和大鼠模型血清中IL-17A、IL-6水平明显上升，IL-10水平明显下降；过表达miR-155后，重症肺炎大鼠血清中IL-17A、IL-6水平明显降低， IL-10水平明显上升，这一结果与外周血中Th17/Treg的变化趋势一致。

综上，重症肺炎患者血清中miR-155的表达明显下降，过表达miR-155后重症肺炎大鼠的肺组织损伤减少，具体的保护机制可能与恢复Th17/Treg的平衡有关。