黄建峰，魏小栋，翟东升

（1.湖北民族大学附属民大医院肝胆胰外科，恩施 445000；2.湖北民族大学附属民大医院心胸外科，恩施 445000）

原发性肝癌属于全世界范围内发病率非常高的恶性肿瘤之一[1]。中国流行病学调查发现原发性肝癌的发病率仅次于肺癌、胃癌及食管癌，高居第4 位[2]。目前，肝癌治疗手段包括肝移植、手术切除及局部消融等，对肝癌的预后有了一定的改善作用，但是肝癌整体预后并不明显，因为较多患者确诊时已是中晚期。因此，寻找治疗原发性肝癌的新方法及新药物已迫在眉睫。索拉菲尼是食品药品监督管理局（FDA）批准的晚期肝癌的标准治疗药物，但由于复发和转移，药物的反应率有所限制[3]。萝卜硫素主要是从蔬菜中提取的天然活性成分，不仅能诱导正常细胞抵抗外来致癌物的能力，对肿瘤细胞也具有抑制作用[4]，其中包括肝癌细胞[5]。萝卜硫素能抑制肿瘤细胞增殖、诱导其凋亡以及增加化疗和靶向药物的敏感性[6-8]。本文将探究萝卜硫素联合索拉菲尼对肝癌HepG2 细胞增殖和凋亡的影响，为肝癌的有效治疗提供理论参考。

1 材料及方法

1.1 材料及试剂 肝癌HepG2 细胞由武汉大学人民医院中心试验室馈赠；萝卜硫素、索拉菲尼购买于Sigma 公司；二甲基亚砜（DMSO）、细胞计数试剂盒8（CCK8）购自Sigma-Aldrich 公司；DMEM 培养基购自Hyclone 公司；Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒购自Hyclone 公司；胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco 公司；发光试剂ECL 购自Millipore 公司；兔抗鼠细胞周期蛋白D1（ClinD1）、C-myc、B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）、磷酸化核因子-κB（p-NF-κB）、磷酸化核因子κB 抑制蛋白α（p-IκBα）及β-actin 抗体购自英国Abcam 公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔二抗购自上海谷歌公司。

1.2 细胞培养及处理 DMEM 培养液（含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素） 用于培养HepG2 细胞，培养箱条件设置为恒温37 ℃、5%CO2，细胞一旦生长融合至80%～90%时，进行1∶2 传代培养。萝卜硫素、索拉菲尼采用DMSO 溶解，储存浓度分别为100 μmol/L 和60 μmol/L，后续实验采用完全培养液稀释成不同浓度来干预细胞。

1.3 CCK8 检测HepG2 细胞增殖 细胞分为对照组、萝卜硫素组、索拉菲尼组及联合给药组，将HepG2 细胞（1×105/mL）均匀接种于96 孔板中，过夜待细胞贴壁后进行药物干预。萝卜硫素浓度为5、10、20、40、60、80 μmol/L，索拉菲尼浓度为2、4、6、10、20、40 μmol/L，联合给药取上述各单药浓度组合。48 h 后吸干培养液，每孔加入20 μL CCK8 试剂，置于培养箱中继续孵育1 h，在酶标仪450 nm 波长读取吸光度A 值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=[1-（药物组A 值－对照组A 值）/（药物组A 值－对照组A 值）]×100%。计算单药的半数抑制浓度（IC50）值及协同作用（CI），CI＜1 表示两种药物有协同效应，CI = 1 表示两种药物有相加效应，CI＞1表示两种药物有拮抗效应。取IC50值的药物浓度作为后续实验的干预剂量。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 细胞分组同“1.3”项，将HepG2 细胞（3×105/mL）均匀接种于6 孔板中，培养24 h 后，进行药物干预，包括萝卜硫素（36 μmol/L）、索拉菲尼（5 μmol/L）及其联合给药。48 h 后，收集细胞，按照Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒操作说明书处理进行细胞凋亡检测。

1.5 蛋白免疫印迹（Western Blot）检测蛋白表达按照“1.4”项处理后收集细胞，置于冰上加入RIPA裂解液充分裂解30 min，4 ℃、12 000 g/min 离心15 min，收集上清，采用二喹啉甲酸（BCA）法检测总蛋白浓度，向上清中加入适量上样缓冲液后100 ℃煮沸7 min，促使蛋白变性。冷切后，每孔上样50 μg进行蛋白电泳，电泳结束后转膜，将NC 膜置于5%脱脂牛奶中封闭2 h；加入稀释后抗体溶液，4 ℃摇床过夜。次日TBST 洗膜3 次，二抗常温反应1.5 h，再用TBST 洗膜3 次，每次10 min。最后ECL 溶液显色4 min 后利用BIO-RAD 成像系统对蛋白图像进行采集。蛋白灰度值采用Image J 软件分析。

1.6 数据统计 利用SPSS 22.0 软件进行数据分析，结果以均值±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 萝卜硫素、索拉菲尼及联合给药对HepG2 细胞增殖抑制率的影响 CCK8 实验数据显示HepG2细胞增殖抑制率随着萝卜硫素、索拉菲尼浓度的增加而增高，萝卜硫素、索拉菲尼单独给药48 h 的IC50分别为（36.8±4.67）μmol/L 和（5.37±0.94）μmol/L，见图1。经计算得各浓度单药联合时的CI 值，结果都低于1，说明萝卜硫素和索拉菲尼具有协同作用。见图2。

图1 CCK8 法检测萝卜硫素和索拉菲尼对HepG2 细胞增殖的作用Fig.1 Effect of sulforaphane and sorafenib on the proliferation of HepG2 cells

图2 萝卜硫素联合索拉菲尼对HepG2 细胞的协同效应Fig.2 Synergistic effects of sulforaphane combined with sorafenib on HepG2 cells

2.2 萝卜硫素、索拉菲尼及联合给药对HepG2 细胞凋亡率的影响 流式细胞术检测HepG2 细胞凋亡情况见图3，其中对照组、萝卜硫素组、索拉菲尼组及联合给药组细胞凋亡率分别为（0.64±0.03）%、（14.06±0.42）%、（16.68±0.07）%及（41.25±1.06）%，可见萝卜硫素和索拉菲尼干预能明显诱导HepG2细胞凋亡（P＜0.05），并且联合给药相对于单药组HepG2 细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。

2.3 萝卜硫素、索拉菲尼及联合给药对HepG2 细胞原癌基因表达的影响 Western Blot 方法分析HepG2 细胞中原癌基因ClinD1、C-myc 表达情况见图4、表1，可见萝卜硫素和索拉菲尼干预能明显抑制ClinD1、C-myc 蛋白表达（P＜0.05），并且联合给药相对于单药组HepG2 细胞中ClinD1、C-myc 蛋白表达显著降低（P＜0.05）。

图3 萝卜硫素联合索拉菲尼对HepG2 细胞凋亡的作用Fig.3 Effect of sulforaphane combined with sorafenib on the apoptosis of HepG2 cells

图4 萝卜硫素联合索拉菲尼对原癌基因表达的影响Fig.4 Effect of sulforaphane combined with sorafenib on the expression of protocancer gene

表1 各组细胞间ClinD1、C-myc 蛋白表达水平的比较（x±s）Tab.1 Comparison of the expression levels of ClinD1 and C-myc proteins（x±s）

2.4 萝卜硫素、索拉菲尼及联合给药对HepG2 细胞凋亡蛋白表达的影响 Western Blot 方法分析HepG2 细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax 的表达情况见图5、表2，可见萝卜硫素和索拉菲尼干预能明显抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达、诱导促凋亡蛋白表达（P＜0.05），并且联合给药相对于单药组HepG2细胞Bcl-2 表达显著降低，而Bax 表达显著升高（P＜0.05）。

图5 萝卜硫素联合索拉菲尼对凋亡蛋白表达的影响Fig.5 Effect of sulforaphane combined with sorafenib on the expression of apoptotic proteins

表2 各组细胞间Bcl-2、Bax 蛋白表达水平的比较（x±s）Tab.2 Comparison of the expression levels of Bcl-2 and Bax proteins（x±s）

2.5 萝卜硫素、索拉菲尼及联合给药对HepG2 细胞NF-κB 信号通路磷酸化的影响 Western Blot 方法分析HepG2 细胞中NF-κB 信号通路蛋白磷酸化的情况，见图6、表3，可见萝卜硫素和索拉菲尼干预能明显抑制NF-κB、IκBα 蛋白磷酸化（P＜0.05），而联合给药相对于单药组HepG2 细胞中NF-κB、IκBα 蛋白磷酸化水平显著降低（P＜0.05）。

图6 萝卜硫素联合索拉菲尼对NF-κB 信号通路的影响Fig.6 Effect of sulforaphane combined with sorafenib on the activation of NF-κB pathway

表3 各组细胞间p-NF-κB、p-IκBα 蛋白表达水平的比较（x±s）Tab.3 Comparison of the expression levels of p-NF-κB and p-IκBα proteins（x±s）

3 讨论

早期研究已指出萝卜硫素具有潜在的抗肿瘤活性，包括抗膀胱癌、肺癌、肝癌等[9-11]。相关研究发现萝卜硫素与化疗或放疗药物联合能对多种肿瘤细胞具有协同作用，而且还可能增强放疗药物介导的肿瘤细胞凋亡、部分逆转肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药性[12-14]。Liu 等[11]研究结果提示，萝卜硫素可通过STAT3/HIF-1α/VEGF 信号通路表现出抗血管生成的药理作用，进而抑制肝癌细胞增殖、诱导其凋亡，提示萝卜硫素对肝癌的预防和治疗具有一定的作用。本文研究发现萝卜硫素、索拉菲尼对肝癌HepG2 细胞的增殖具有明显抑制作用，而且还诱导其凋亡。然而，联合给药时细胞的生长抑制作用相对单药组更为显著，并通过计算联合给药指数CI发现均小于1，说明萝卜硫素与索拉菲尼联合给药表现出协同作用。

近期已有研究证实NF-κB 信号通路活化能介导细胞周期、凋亡相关因子的表达，包括原癌基因（ClinD1、C-myc）和凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax）等，进而参与肿瘤的发生发展[15]。NF-κB 信号通路激活与原发性肝癌密切相关[16]，并且药物通过抑制该信号传导，还能抑制肝癌细胞增殖、降低氧化应激及炎症反应[17]。萝卜硫素具有较强的抗肿瘤活性，并且发现其能通过抑制NF-κB 信号通路活化，进而增强化疗药物对肿瘤细胞的敏感性[18]。本文研究发现萝卜硫素联合索拉菲尼能明显抑制NF-κB 和IκBα蛋白的磷酸化水平，进而下调了NF-κB 信号通路传导。

CyclinD1 是细胞周期家族中与肿瘤发展最为密切的成员，作为一种重要的原癌基因，是诱导肿瘤细胞由G1/S 期进入G2 期的重要分子，过表达能导致细胞过度生长、转化与癌变[19-21]。Bcl-2 和Bax的异常表达与肝癌的发生发展、组织学类型及预后密切相关[22-24]；并且NF-κB 信号传导能调节ClinD1、C-myc、Bcl-2 及Bax 基因的表达[25-28]。本实验发现萝卜硫素联合索拉菲尼能明显抑制ClinD1、C-myc及Bcl-2 蛋白表达，诱导Bax 蛋白表达。早期研究表明萝卜硫素可通过降低细胞周期相关蛋白ClinD1和C-myc 表达，并调节凋亡相关蛋白Bcl-2 和Bax表达，发挥抗肿瘤的生物学作用[29]。综上所述，萝卜硫素与索拉菲尼联合能共同抑制NF-κB 信号通路，发挥协同抗肝癌的作用。