邢 力 王经伟 郑炜达

（1.吉林农业科技学院生物与制药工程学院 吉林市 132101 2.吉林市昌邑区孤店子镇畜牧站 吉林市 132101）

泡盛曲霉广泛存在于土壤与腐败有机质中，生命力强。研究表明泡盛曲霉具有纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、阿魏酸酯酶、单宁酶、植酸酶等多种酶活力[1-4]，且其内毒素和外毒素非常低，在麦麸、玉米皮、蔗渣、秸秆、菌糠等资源深加工和再利用具有很广泛的应用前景。目前对泡盛曲霉产生阿魏酸酯酶方面的研究取得很好的成果并已经商用，但是对其产纤维素酶的研究较少。本试验通过紫外诱变诱导泡盛曲霉突变，提高泡盛曲霉对纤维素的分解能力，为纤维素含量高的农业废弃物再利用提供有效途径。

1 材料与方法

1.1 材料

材料：泡盛曲霉，课题组从吉林市猴石山遗址林下腐殖土分离纯化并鉴定。

试剂：标准葡萄糖溶液（1mg/mL）、DNS试剂。

刚果红培养基：K2HPO40.5g，微晶纤维素1.88g，MgSO40.25g，明胶 2.0g，刚果红 0.2g，琼脂 14.0g，蒸馏水 1000mL。

马铃薯葡萄糖糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200g，葡糖糖20g，琼脂 20g，水 1000mL。

液体培养基：马铃薯200g，取其浸出液，加入2g羧甲基纤维素定容至1000mL，灭菌。

1.2 试验方法

1.2.1 泡盛曲霉菌种活化

将泡盛曲霉菌种塑料冻存管立即放入40℃水浴中1min快速复苏，将泡盛曲霉接入PDA斜面培养基中，在恒温培养箱中24℃培养3d。将培养3d的泡盛曲霉转入新的PDA培养基中继续培养3d。重复此步骤2～3次以更好活化泡盛曲霉菌种，让菌种逐渐适应环境。

1.2.2 泡盛曲霉的紫外诱变

1.2.2.1 泡盛曲霉孢子悬液最佳诱变浓度

用灭菌生理盐水15mL将斜面培养基上的泡盛曲霉孢子冲洗到平皿中，得到泡盛曲霉孢子悬液，取1mL孢子悬液用血球计数板计数，对孢子悬液进行梯度稀释 1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5。每种浓度取5mL放入平皿中，置于磁力搅拌器上，在20W紫外灯下，距离30cm，避光照射30S。

取0.1mL照射后的不同孢子浓度的悬液涂布于PDA培养基，用牛皮纸将培养皿包好，在恒温培养箱中暗光条件24℃培养24h，将牛皮纸取下继续在24℃培养24h后取出计数。

1.2.2.2 泡盛曲霉孢子悬液适宜浓度下进行紫外突变

将长满泡盛曲霉孢子的PDA斜面培养基用15mL灭菌生理盐水得泡盛曲霉孢子悬液，取1mL悬液放在血球计数板上计数，用灭菌生理盐水稀释剩余14mL孢子悬液至适宜浓度，取5mL放入平皿中，置于磁力搅拌器上，在20W紫外灯下，距离30cm，避光照射30S。

1.2.3 突变菌株筛选与传代

1.2.3.1 突变菌株的筛选

取1mL照射后的孢子悬液涂布于刚果红培养基上，制备50个平板，用牛皮纸将培养皿包好，暗光条件24℃培养24h，将牛皮纸取下继续在24℃培养48h。培养完成后，选取出现透明圈的菌落，然后对菌落直径大小、透明圈直径大小进行一一测量，选取透明圈直径与菌落直径比值大的菌落，挑取菌落接种在PDA培养基上，在恒温培养箱中24℃培养3d。

1.2.3.2 突变菌株传代培养

将筛选得到的突变菌株经培养后，接种在新的PDA培养基上，在恒温培养箱中24℃培养3d以稳定突变后性状。

1.2.4 液体培养

用10mL灭菌生理盐水分别将突变前的菌落与突变后的菌落上的孢子洗脱下来，取1mL孢子悬液放在血球计数板上计数，将两组孢子悬液稀释至相同浓度，取2mL孢子悬液并分别接种在灭菌50mL马铃薯羧甲基纤维素液体培养基中，在恒温摇床培养箱中100rpm24℃培养24h，获取发酵液。

1.2.5 DNS法测发酵液中还原糖含量

利用羧甲基纤维素能够被纤维素酶分解成还原糖这一特性，用马铃薯浸出液与羧甲基纤维素配制液体培养基，用DNS法测定菌株的液体培养基发酵液还原糖量来比较泡盛曲霉突变前后分解纤维素的能力。

1.2.5.1 标准曲线制作：取葡萄糖标准液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL分别加入试管中，加入蒸馏水至1mL，再分别加入DNS试液2mL，沸水浴2min，冷却，定容至15mL，540nm测定各管吸光度。

1.2.5.2 菌株发酵液葡萄糖浓度测定：取发酵液10mL，5000rpm离心5min，取上清液1mL加入9mL蒸馏水制备稀释液。取1mL稀释液加入2mLDNS试剂，摇匀，沸水浴2min，冷却，定容至15mL，540nm测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 泡盛曲霉孢子最佳诱变浓度的确定

经过对梯度稀释的泡盛曲霉孢子悬液进行紫外诱变得到最佳诱变孢子悬液稀释倍数1×10-3，如表1所示。各种微生物对紫外诱变的紫外线计量、照射时间、照射距离、温度、pH值及微生物浓度都不相同，需要试验来确定最佳的突变因素，紫外线计量的大小直接影响着菌体突变率，但是紫外线计量大会曾加菌体死亡，太小不会成功诱变。所以需要对各种因素进行实验，以达到最佳诱变的因素。在紫外诱变过程中需要在无光或红光条件下进行，乃至初期培养需要在避光条件下进行，防止光复活作用，导致紫外突变结果不明显。如果用紫外线直接诱变泡盛曲霉菌丝体，会导致其突变性状在传代过程中消失，突变效果不明显，故用其孢子体进行紫外诱变，能够有效的改变这一问题。

在稀释倍数1×10-4与1×10-5下进行紫外诱变，菌株存活为0，是因为孢子浓度低，导致在紫外线作用下全部被杀死；稀释倍数1×10-1和1×10-2下，孢子浓度太高，突变率低，同时菌株太多不利于后期筛选工作，故选稀释倍数用1×10-3下进行紫外诱变。

表1 孢子浓度稀释倍数与存活菌量

对稀释倍数用1×10-3计数得到结果为1.6×103个/mL。

2.2 突变菌株的筛选结果

突变前菌株透明圈有菌落大小比值为1.102。对泡盛曲霉孢子进行紫外诱变，并对突变菌株的透明圈与菌落大小一一测量，产生正突变菌株共计61株，其中比值最大为1.403，为41号菌落。41号菌落具有透明圈与菌落大小比值比原菌落比值大的优点，且菌落大小也比原菌落大，说明其繁殖能力强，产纤维素酶量高，其分解纤维素能力强，故选择41号突变菌株作为以下试验用菌株。如图2所示。但是仅对其透明圈与菌落大小的比值还不足以说明其分解纤维素能力比原菌落高，需要对两种菌株分解纤维素能力进行对比，才能得出结论。

2.3 发酵液中还原糖含量

用DNS法测还原糖含量,葡萄糖标准曲线如图1所示，y=0.5467x-0.0102，R2=0.9982。

图1 葡萄糖标准曲线

2.4 测定发酵液中还原糖浓度

分别测量突变前菌株与突变菌株的发酵液吸光度值，如表2所示。通过DNS法测定原菌落与突变菌落发酵液中羟甲基纤维素被纤维素酶分解产生的还原糖进行对比，突变菌落发酵液中还原糖含量为0.61mg/mL，突变前菌落酵液中还原糖含量为0.32mg/mL。由于两组所用的液体培养基采用相同的配制方法，同一批次，培养时间、温度、光强等条件相同，说明突变菌株比突变前菌株分解纤维素能力明显提高。

表2 突变前菌株与突变菌株吸光度值对应的葡萄糖浓度

3 结论

3.1 孢子悬液的浓度对紫外诱变的效果有着至关重要的影响。本试验结果表明孢子悬液浓度为1.6×103浓度下，紫外诱变的条件为在20W紫外灯下，距离30cm，避光照射30S紫外诱变效果最佳，试验中仅对6个不同梯度稀释的孢子悬液进行紫外诱变，紫外诱变的紫外线计量、照射时间、照射距离、温度、pH值等因素尚有待进一步探究。

3.2 通过对泡盛曲霉孢子进行紫外突变共产生61株突变菌株，其中41号菌株与突变前菌株和其它突变菌株相比透明圈直径与菌落直径比最大，而且菌体生长力强。

3.3 通过对比突变前后两组发酵液中还原糖含量可知，突变菌株发酵液中还原糖含量明显比原菌株发酵液含量高。说明突变菌株分解纤维素能力比突变前菌株分解能力强，紫外诱变对于泡盛曲霉产纤维素酶菌株选育是一种有效改良技术。