石贤清,孙叶英,朱春荣

直肠癌是比较常见的消化道恶性肿瘤，该病发生主要与饮食、生活环境、遗传等因素有关[1]。研究表明对直肠癌患者而言，以p53基因最容易发生异常改变，野生型p53对细胞凋亡有诱导作用，可负性调节细胞周期[2]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的重要组成部分，它对细胞凋亡有抑制作用，有利于细胞增殖[3-4]。有学者发现Survivin在胚胎、肿瘤组织内存在表达，它与癌细胞转移、增殖有关[5]。本研究旨在分析p53蛋白与Survivin蛋白表达对直肠癌患者预后的评估价值，便于了解二者与预后的关系，提出更合理的治疗方案，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取两院2013年12月至2016年12月收治的直肠癌患者90例，所有患者均行直肠癌根治术。其中男48例，女42例，年龄30～76岁，平均(51.29±14.78)岁；临床分期：Ⅰ期17例、Ⅱ期38例、Ⅲ期35例；脉管浸润：有39例，无51例；组织学分型：低分化30例、中分化37例、高分化23例。研究方案获得两院医学伦理委员会批准。

1.2 入选标准

1.2.1 诊断标准 参考卫生部医政司[6]编制的《结直肠癌诊疗规范(2010年版)》诊断：①临床表现为血便、便秘、排便梗阻等；②经直肠指检，可触摸到肿块，质硬；③经腹盆腔CT、盆腔MRI提示有肿瘤；④经病理检查证实为直肠癌。

1.2.2 纳入标准 ①诊断明确；②术前无放疗、化疗史；③未见远处转移；④患者对本研究知情同意。

1.2.3 排除标准 ①有根治性手术禁忌，行保守治疗；②肛门形态、功能异常；③心、脑、肝、肾等脏器损害；④凝血障碍；⑤合并其他恶性肿瘤；⑥重度感染。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化检测方法 经免疫组化法测定病灶组织内p53蛋白、Survivin蛋白表达情况。主要试剂包括兔抗Survivin抗体(迈新生物)、鼠抗p53抗体试剂(迈新生物)、DAB显色试剂(迈新生物)。主要仪器包括恒温箱(乐普纳科技)、显微镜(乐普纳科技)、显微成像系统(PARK公司)、低温冰箱(乐普纳科技)、切片机(乐普纳科技)。在开始试验前，反复冲洗盖玻片、载玻片，并浸入浓硫酸内，盖玻片烤3 h，载玻片约烤7 h，待烤干后，将其捞出。经蒸馏水反复漂洗，于95%乙醇内浸泡，过夜。完成上述操作后，将其取出，置于37 ℃烤箱内，确保完全干燥后，将其取出备用。选取标本组织，于切片机上固定，切片厚度约4 μm，在37 ℃环境下过夜。免疫组化过程：①将切片在65 ℃条件下反应45 min。②常规脱蜡，利用二甲苯Ⅰ、Ⅱ分别反应10 min，经无水酒精Ⅰ、Ⅱ分别反应10 min，置于不同浓度的乙醇内(浓度分别为95%、90%、80%、70%)，分别反应5 min、2 min、2 min、2 min，经PBS液体完成3次冲洗，3 min/次。③取枸橼酸盐缓冲液经高压锅煮沸，将玻片放置在修复液内反应3 min，将其取出，待冷却后经PBS液体进行3次冲洗，5 min/次。④取过氧化氢(50 μL，浓度为3%)加入切片，孵育10 min，将内源性过氧化物酶活性阻断，经PBS液体进行3次冲洗，3 min/次。⑤通过浸泡将残留的PBS液去除，取第一抗体50 μL加入切片，在室温环境下孵育60 min，将其取出后，经PBS液进行3次冲洗，3 min/次。⑥将残留的PBS液去除，取快捷免疫组化试剂50 μL加入切片，在室温环境下孵育10 min，经PBS液体进行3次冲洗，1 min/次。⑦将残留的PBS液去除，取DAB显色剂加入切片，避光显色。⑧经苏木素进行复染，时间为2 min，盐酸分化，取出后冲洗3次，于温水内返蓝，时间为5 min。⑨脱水、封片。结果判断：当细胞浆内有淡黄色至棕黄色颗粒形成，提示Survivin蛋白为阳性，当胞核内有黄褐色、棕黄色颗粒形成，则提示p53蛋白为阳性[3]。

1.3.2 Western blot检测 取黏膜组织100 mg，加1 mL裂解液、10 mL缓冲液，粉碎组织，匀浆，冰浴30 min，4 ℃离心，取上清液，紫外可见分光度仪检测蛋白浓度(BCA法)，蒸馏水稀释样本5 μg/μL，-70 ℃下保存，取样本10 μL、5 μL预染Marker，加上样缓冲液，混合后100 ℃煮沸蛋白，变性5 min，7.5%、12%凝胶电泳分离1、2 h，电转30 min，将硝酸纤维膜取出，染色1 min，标记并用5%脱脂奶粉洗脱若干次，浸入封闭液内1 h，加一抗(兔抗人survivin多克隆抗体)及封闭液均匀滴在聚偏氟乙烯膜表面，4 ℃过夜，二抗1∶50稀释在BSA内，均匀滴于PVDF膜表面，DAB显色、照相。

1.4 观察指标

比较癌灶组织、癌旁组织的p53、Survivin蛋白阳性、阴性表达情况，并记录二者蛋白表达等电点值(PI)。术后通过电话随访2年，根据患者2年内的生存、死亡情况，分成生存组、死亡组，比较两组癌组织的p53与Survivin蛋白表达水平，记录两组PI值，绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析二者对患者预后的预测价值，明确曲线下面积、最佳截断值以及相应的敏感度、特异度。

1.5 统计学方法

经SPSS 20.0软件处理数据。计数资料用%表示，组间比较采用2检验，同一患者的癌组织和癌旁组织的计数资料采用配对样本2检验;计量资料用表示，采用t检验;采用ROC曲线分析p53和Survivin蛋白PI值对患者预后的预测价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌灶组织、癌旁组织的p53、Survivin蛋白表达比较

免疫组化显示癌灶组织的p53、Survivin蛋白阳性表达(图1、图2)，癌灶和癌旁组织p53蛋白、Survivin蛋白情况见下表1和表2，差异有统计学意义(均P=0.000)。Western blot检测(图3)显示癌灶组织的p53、Survivin蛋白表达灰度值均高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表1不同组织内p53蛋白阳性率

表2不同组织内Survivin蛋白阳性率

图1Survivin蛋白阳性表达(SP×100)图2p53蛋白阳性表达(SP×100)

图3p53、Survivin蛋白表达(Western blot)

表3癌灶组织和癌旁组织p53、Survivin蛋白的灰度值

2.2 癌灶组织、癌旁组织的p53、Survivin蛋白PI值比较

癌灶组织的p53、Survivin蛋白PI值显著高于癌旁组织(均P<0.05)，见表4。

表4癌灶组织、癌旁组织的p53、Survivin蛋白PI值比较

2.3 生存组、死亡组的p53、Survivin蛋白表达比较

通过2年随访，在90例患者中，有29例死亡，占32.22%，61例生存，占67.78%。死亡组p53、Survivin蛋白阳性率高于生存组，组间比较有统计学差异(P<0.05)，见表5。

表5生存组、死亡组的p53、Survivin蛋白表达阳性率比较[n(%)]

2.4 生存组、死亡组的p53、Survivin蛋白PI值比较

死亡组的p53、Survivin蛋白PI值高于生存组，两组比较有统计学差异(P<0.05)，见表6。

表6生存组、死亡组的p53、Survivin蛋白PI值比较

2.5 p53、Survivin蛋白PI值对患者预后的预测价值

分别以p53、Survivin蛋白PI值为检验变量，以是否发生死亡为状态变量，绘制ROC曲线(图4、图5)，结果提示，p53、Survivin蛋白PI值预测直肠癌患者预后的曲线下面积分别为0.892、0.798，以p53蛋白PI>90.12、Survivin蛋白PI>87.72时，患者死亡风险较高，见表7。

表7p53、Survivin蛋白PI值对患者预后的预测价值

3 讨论

本研究发现与癌旁组织相比，癌症组织中的p53、Survivin蛋白阳性率明显增高，且p53、Survivin蛋白PI值上调。Survivin属于凋亡抑制因子，既往有研究证实其在结直肠癌的病灶组织中呈高表达[7]，与本研究结论相符。另有研究发现Survivin与结直肠癌患者的T分期、淋巴结转移、组织学分型等病理特征存在关联[8-10]。这可能的机制在于对恶性肿瘤患者而言，会有较多新生血管形成，而在这过程中，血管内皮生因子对Survivin高表达存在诱导作用，这为肿瘤血管生成提供了有利条件[11]。p53蛋白可分成突变型、野生型两类，其中野生型对细胞凋亡、衰老存在促进作用，有利于维持基因稳定性[12-14]。而突变型则不具备抑癌作用，且对野生型p53蛋白活性有抑制功能，可导致细胞转化加强[15]。本研究提示癌症组织内的p53蛋白阳性率高于癌旁组织，这可能是因患者突变型P53基因分布较多，且分布广泛所致。

图4p53蛋白预测患者预后的ROC曲线

图5Survivin蛋白预测患者预后的ROC曲线

通过分析生存组、死亡组患者的p53、Survivin蛋白表达，提示死亡组p53、Survivin蛋白表达阳性率更高，由此可推测，p53和Survivin的表达情况对患者预后影响较大。Survivin影响预后的机制可能如下：①它对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-7有抑制作用，能将细胞凋亡途径阻断，导致肿瘤病情加重[16]；②它能结合于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9，对其活性存在抑制功能，可进一步促进细胞异型增殖，加重病情，影响预后[17]。有学者发现p53蛋白具有较多突变位点，且在组织内广泛分布，可促进细胞异型增殖，导致细胞增殖、凋亡处于失衡状态，利于肿瘤生长[18-19]，这可能是p53蛋白影响直肠癌患者预后的重要机制。

本研究的创新之处在于绘制了ROC曲线，证实p53、Survivin蛋白PI值对患者预后具有一定预测价值，临床需对此引起重视。研究表明野生型P53可负性调节Survivin的表达，且二者在大肠癌病灶中的表达呈正相关[20]。这表明p53蛋白阳性率越高，则Survivin蛋白阳性风险也越高。尤其对突变型P53基因而言，其原本自带的生物学功能丧失，导致细胞周期蛋白分泌量增加，促使其调控功能下降，有利于受损DNA存活，形成癌症。此外，Survivin蛋白上调则可将抗肿瘤凋亡机制启动，促进癌细胞增殖，二者相互作用，形成恶性循环，增加死亡风险。

综上，与癌旁组织相比，直肠癌组织中p53、Survivin蛋白表达阳性率明显上调，且死亡患者的p53、Survivin蛋白表达阳性率高于生存患者，p53、Survivin蛋白PI值也高于生存患者，临床可将二者作为评估患者预后的重要指标。然而，本研究也有不足，如纳入样本量少，未来将扩大样本量，对此进行探讨。