赵平，王健,李荣军,付丽

胃癌是人类的常见恶性肿瘤之一，其发生发展包含一系列复杂的分子生物学过程，了解其增殖、分化、转移的相关机制对胃癌的治疗具有重要作用[1]。目前，胃癌的主要治疗方法包括手术、放化疗以及内分泌治疗，但是患者预后依然较差，生物靶向治疗癌症已成为近年来的研究热点[2-3]。解聚素-金属蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease, ADAM)是位于细胞膜表面的一类糖蛋白家族，有研究表明ADAM与恶性肿瘤的增殖、侵袭、转移有关[4]。ADAM17是ADAM家族的成员之一，又称之为肿瘤坏死因子-α转化酶(TACE)，ADAM17具有降解细胞基底膜及胞外基质的作用，还能影响组织重塑并参与肿瘤细胞增殖、浸润、转移过程[5]。ADAM17是否也参与胃癌组织的增殖、侵袭，目前相关的报道较少，本文旨在通过ADAM17siRNA转染人胃癌SGC-7901细胞，探索ADAM17对人胃癌SGC-7901细胞增殖、侵袭的影响及其可能存在的作用机制研究，为生物靶向治疗胃癌药物设计提供试验参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人胃癌SGC-7901购自美国典型物种保藏中心；ADAM17siRNA及无义序列购自Invitrogen；Lipofectamine 2000购自Invitrogen；细胞培养基RPMI-1640、胎牛血清以及转染试剂购自赛默飞世尔科技公司；Transwell小室、Matrigel基底膜购自美国BD公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒及荧光定量试剂均购于TaKaRa公司；β-actin鼠单克隆抗体和辣根过氧化酶(HRP)标记兔抗鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术公司；CCK-8试剂盒、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin抗体均购自碧云天公司；ADAM17、Snail、p-p38等抗体均购自美国Santa Cruz公司。

1.3 细胞转染及检测

采用含10%热灭活胎牛血清的RPMI 1640培养液培养胃癌细胞SGC-7901，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，隔天换液。将培养细胞分为Ctrl组、ADAM17-siRNA组。转染前24 h接种细胞，将ADAM17 siRNA及其无义序采用脂质体Lipofectamine 2000转染人胃癌细胞SGC-7901，操作严格按照说明进行。采用Western blotting及RT-PCR对两组人胃癌细胞SGC-7901的ADAM17的蛋白及基因水平进项检测，以GAPDH作为内参。

1.4 转染后胃癌细胞的增殖

采用CCK-8法检测细胞增殖情况，取对数生长期SGC-7901细胞，将细胞悬液密度调整为5×103/mL，接种于96孔培养板中，每孔体积200 μL，于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养24 h，分别加入终浓度为5.4 μmol/L的sCLU或者BSA培养基，继续培养，于0 d、1 d、2 d、3 d、4 d进行CCK-8检测，严格按试剂盒操作说明操作，在酶联免疫检测仪上检测波长为450 nm处各孔的吸光度(A)值，统计4 d结果绘制细胞生长曲线及培养48 h时各组细胞增殖率。

1.5 转染后胃癌细胞周期分布

取对数生长期SGC-7901细胞，将细胞悬液密度调整为2.5×104/mL，接种于6孔板中、400 μL/孔、培养48 h后收集各组细胞，1 000 r/min离心5 min，PBS洗涤2次，加入1 mL 75%乙醇、-20 ℃ 固定24 h，加入0.4 μL PI(30 mg/mL)混合，避光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞周期，ModFit LT分析并拟合计算各时期细胞百分比。

1.6 转染后胃癌细胞的侵袭、迁移力

Transwell检测细胞的侵袭能力，取100 μL稀释好的基质胶均匀覆盖于Transwell小室底部。取对数生长期SGC-7901细胞，用0.2% 胰蛋白酶进行消化，以含1%小牛血清的培养液调整细胞浓度为2×105/mL。取100 μL稀释好的细胞悬液加于上室，37 ℃ 5% CO2条件下培养48 h，取出Transwell小室，按照Hemacolor Kit说明书进行固定、染色，膜的下室面表面的细胞为侵袭的细胞，显微镜下拍照、计数，共计数5个视野，取平均值。实验设置3个平行小室，重复3次，以穿膜的肿瘤细胞数目多少为评价其侵袭力的指标。

划痕试验检测细胞迁移能力，将各组转染后对数生长期SGC-7901细胞接种到96孔板，常规培养，待细胞长满单层，弃去培养基，用灭菌的移液枪头在皿底划一直线，洗涤3次，常规培养，于显微镜下观察划痕处细胞生长情况，根据划痕宽度计算细胞迁移率。

1.7 Western blotting

提取培养48 h后细胞总蛋白，用Bradford将各组蛋白浓度调整一致，经SDS-PAGE凝胶电泳、电转膜至PVDF膜，密封2 h，加入兔抗人ADAM17、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Snail、GAPDH一抗(1∶500)，4 ℃ 孵育过夜，TBST漂洗40 min，加入HRP标记的二抗(1∶500)孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL试剂盒与DNR BioImaging System观察膜上蛋白条带，收集影像，采用凝胶图像处理系统软件分析各组条带灰度值，依据相对灰度值进行统计学分析。

1.8 RT-PCR

采用TRIzol试剂提取细胞总RNA，Revertaid First Strand cDNA合成试剂盒将RNA中反转录合成cDNA，SYBR-Green PCR Mix 检测mRNA的表达水平。PCR参数设置：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s、40个循环。所用引物(上海生工)信息如下：GAPDH，5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′、5′-AGGGGCCAT-CCACAGTCTTC-3′；p21，5′-TGCATCAGATCTCTG-CCATT-3′、5′-TGGACGTCATCTGCAACTTC-3′；p27，5′-GCCCAACGCACCGAATAG-3′、5′-TGATCTAAG-TTTCCCGAGGTT-3′；ADAM17，5′-ATCCAAACCC-TTTCCTGCG-3′、5′-CAAACCCATCCTCGTCCA-3′；CyclinE1，5′-CTGGATGTTGACTGCCTTGA-3′、5′-TCTTTGGTGGAGAAGGATGGGGTGG-3′；CyclinD1，5′-GCGTTGCTCTGATGGTGA-3′、5′-CAGCGTGATG-ATGGTAGG-3′，应用PCR和2-ΔΔCq法分析相关基因表达数据。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 人胃癌SGC-7901细胞ADAM17-siRNA验证

Western blotting检测结果显示ADAM17-siRNA SGC-7901细胞中ADAM17水平低于Ctrl，差异有统计学意义(P<0.01)(图1A、B)；RT-PCR检测结果显示ADAM17-siRNA SGC-7901细胞中ADAM17表达水平低于Ctrl，差异有统计学意义(P<0.01)(图1C)。

2.2 ADAM17-siRNA人胃癌细胞SGC-7901增殖降低

观察ADAM17-siRNA组及Ctrl组SGC-7901细胞生长情况，结果显示两组培养至4d时，与Ctrl组相比，ADAM17-siRNA人胃癌细胞SGC-7901增殖倍数显著降低(P<0.05)(图2A)；CCK-8结果显示ADAM17-siRNA组细胞增殖率显著低于Ctrl组(P<0.05)(图2B)；FCM结果显示ADAM17-siRNA组处于G0/G1期的细胞比例增加，而处于S期、G2/M期的细胞比例降低，与Ctrl组差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)(图2C)；RT-PCR结果显示ADAM17-siRNA组细胞中CyclinD1、CyclinE1表达水平降低，而p21、p27表达水平上升，与Ctrl组差异有统计学意义(P<0.01)(图2D)。

图1人胃癌SGC-7901细胞ADAM17-siRNA验证 A：ADAM17-siRNA SGC-7901细胞及其阴性对照组(Ctrl)ADAM17的Western blotting凝胶成像结果；B：为A图ADAM17蛋白表达量数据统计结果；C：ADAM17-siRNASGC-7901细胞及其阴性对照组(Ctrl)ADAM17的RT-PCR检测结果。与Ctrl对比，**P<0.01,***P<0.001

图2ADAM17-siRNA抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖 A：ADAM17-siRNASGC-7901细胞及其阴性对照组(Ctrl)细胞生长曲线；B：ADAM17-siRNASGC-7901细胞及其阴性对照组(Ctrl)细胞增殖率统计结果；C：ADAM17-siRNASGC-7901细胞及其阴性对照组(Ctrl)处于G0/G1期、S期、G2/M期细胞比例统计；D：ADAM17-siRNASGC-7901细胞及其阴性对照组(Ctrl)CyclinD1、CyclinE1、p21、p27的RT-PCR检测结果。与Ctrl对比，**P<0.01,*P<0.05

2.3 ADAM17-siRNA降低人胃癌SGC-7901细胞侵袭能力

划痕试验显示，ADAM17-siRNA组细胞迁移率显著低于Ctrl组(P<0.01)(图3A、B)；Transwell试验显示ADAM17-siRNA组细胞侵袭程度减弱，ADAM17-siRNA组细胞侵袭数目显著低于Ctrl组(P<0.01)(图3C、D)。Western blotting检测结果显示，ADAM17-siRNA组E-cadherin水平增加，Snail、N-cadherin与Vimentin含量降低，与Ctrl组差异均有统计学意义(P<0.05)(图4)。

图3ADAM17-siRNA抑制人胃癌SGC-7901细胞侵袭能力 A：ADAM17-siRNASGC-7901细胞及其阴性对照组(Ctrl)细胞迁移能力情况；B：为A图细胞迁移率数据统计；C：ADAM17-siRNASGC-7901细胞及其阴性对照组(Ctrl)细胞侵袭情况；D：为C图细胞侵袭数目统计；与Ctrl对比，**P<0.01

图4ADAM17-siRNA对人胃癌SGC-7901细胞EMT相关蛋白的影响 A：ADAM17-siRNASGC-7901细胞及其阴性对照组(Ctrl)细胞EMT相关蛋白Western blotting凝胶成像结果；B：为A图中各EMT蛋白表达水平统计结果；与Ctrl对比，**P<0.01,*P<0.05

3 讨论

我国是胃癌高发区且胃癌发病人数占世界胃癌总人数的40%[6]。ADAM17是ADAM家族成员之一，具有促进细胞膜释放TNF-α作用并参与癌症形成，ADAM17高表达与乳腺癌癌、宫颈癌及肝癌等具有密切关系[7-9]。RNA干扰(RNAi)是通过siRNA激活对靶基因具有特异性抑制作用的技术手段，siRNA主要以shRNA的形式整合至载体中然后再转染至目标细胞核中，从而对目的基因实现基因沉默的作用[10]。Aydin等[11]研究显示ADAM17水平对胃癌患者根治术后复发及预后不良具有一定的预测价值。葛志鹏等[5]人研究发现沉默ADAM17可以抑制人甲状腺乳头状癌K1细胞生长。Meng等[12]研究结果显示ADAM17-siRNA可以抑制乳腺癌细胞MCF-7生长。由此猜测沉默ADAM17可能也会对胃癌细胞生长产生影响，本研究通过构建ADAM17 siRNA胃癌细胞SGC-7901来探究ADAM17对胃癌细胞生长的影响。Western blotting、RT-PCR实验结果显示，ADAM17-siRNA胃癌细胞SGC-7901细胞DAM17水平、DAM17表达量均明显低于阴性对照，表明ADAM17siRNA转染胃癌细胞SGC-7901成功。

本研究结果显示，ADAM17-siRNA胃癌细胞SGC-7901生长速率降低、细胞增殖倍数也下降。癌症形成与细胞增殖具有密切关系，癌细胞具有无限增殖的特点[13]。乳腺癌MCF-7细胞中ADAM17沉默后，MCF-7细胞增殖速率降低且细胞周期明显受到抑制[14]。ADAM17-siRNA胃癌细胞SGC-7901生长受到抑制，有可能与细胞周期抑制有关。细胞周期检测结果显示，ADAM17-siRNA胃癌细胞SGC-7901 G0/G1期细胞数目增加，S期、G2/M期细胞数目减少，此结果与前人研究结果相似，提示抑制ADAM17表达可以诱导胃癌细胞SGC-7901在G0/G1期发生细胞周期阻滞，影响细胞增殖。

许多细胞生长因子参与了细胞周期过程[15]，其中周期蛋白在细胞分裂增殖的过程具有重要作用，cyclin D1及cyclin E1均是细胞周期蛋白家族的成员之一，cyclin D1能与CDK4或者CDK6相结合形成复合体进而激活CDKs，而cyclin E1与CDK2结合，促使细胞周期从G1期进入S期[16-17]。cyclinD1、cyclinE1表达异常会导致细胞周期增殖失调，与肿瘤、癌症的发生具有重要关系[18-19]。Cip/Kip家族作为CDK抑制子也参与细胞周期调控，其中p21、p27也是Cip/Kip家族成员。p21与p27均可以通过其氨基酸末端的结构域抑制CDK活性，促使细胞于G1期停滞[20-21]，部分恶心肿瘤组织p21、p27水平均下降或者缺失[22]。本研究结果显示，ADAM17-siRNA胃癌细胞SGC-7901cyclinD1、cyclinE1表达水平降低，而p21、p27表达量增加，表明ADAM17siRNA可以降低cyclinD1、cyclinE1表达水平，增加CDK抑制子p21、p27表达量，使细胞周期G0/G1期出现阻滞，从而抑制胃癌SGC-7901细胞增殖。

ADAM17参与恶心肿瘤的侵袭有关，ADAM17沉默可以抑制非小细胞肺癌迁移和侵袭[23]，本研究划痕及Transwell试验结果显示，ADAM17-siRNA SGC-7901细胞迁移及侵袭能力均降低，表明ADAM17对胃癌细胞SGC-7901侵袭、迁移有促进作用，下调ADAM17表达可以降低胃癌细胞SGC-7901迁移及侵袭能力。恶性肿瘤细胞侵袭、转移与上皮间质转化(EMT)有着密切关系[24]，Xu等[25]研究发现EMT过程的主要特征为上皮标志物E-Cadherin水平降低甚至丧失，间叶组织特有指标蛋白Vimentin、N-Cadherin蛋白含量增加。Snail为EMT的关键调控因子，与多种肿瘤EMT发生有关[26]。本文研究结果显示ADAM17-siRNA SGC-7901细胞E-Cadherin水平增加，Vimentin、N-Cadherin、Snail含量降低，表明下调ADAM17表达，可以降低Vimentin、N-Cadherin及Snail含量，增加E-Cadherin水平，使胃癌细胞SGC-7901 EMT减弱，导致胃癌细胞SGC-7901侵袭迁移能力降低。由此表明，ADAM17可以通过调节E-Cadherin、Vimentin、N-Cadherin及Snail水平，促进胃癌细胞SGC-7901侵袭迁移能力。

综上所述，ADAM17-siRNA一方面可以下调人胃癌细胞SGC-7901cyclinD1、cyclinE1表达量，上调p21、p27表达量，使胃癌细胞SGC-7901于G0/G1期阻滞，细胞周期受阻，导致细胞增殖受到抑制；ADAM17-siRNA另一方面可以降低Vimentin、N-Cadherin及Snail含量，增加E-Cadherin水平，抑制胃癌细胞SGC-7901 EMT，降低细胞侵袭、迁移能力。本文是基于细胞体外实验进行探索，临床是否也存在相同的趋势，还需要进一步研究。