冯馨慧，刘志明，王海英*

(1.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨150040； 2.东北林业大学材料科学与工程学院，黑龙江 哈尔滨150040)

暴马丁香(Syringareticulatavar.amurensis)，又名暴马子(东北)，木犀科(Oleaceae)丁香属(Syringa)植物，叶片厚纸质，宽卵形、卵形至椭圆状卵形，产于黑龙江、吉林、辽宁，是较好的绿化观赏树种[1]。暴马丁香的树皮、树干及茎枝均可入药[2]，其化学成分研究主要集中于枝干及树皮部分[3]，其中暴马丁香树皮中紫丁香苷和橄榄苦苷含量较高，是具有多种药理活性的天然药用成分[4]，因此其全皮及内皮水煎液对肺炎双球菌和流感杆菌有中度抑菌作用[5]。此外，相比于其他种类的丁香[6,7]，暴马丁香花挥发油中含有一定量的烯烃和烷烃化合物，其特有的宜人香味和药用价值可能与这些成分的存在有关[8,9]。据报道，暴马丁香叶中已分离出5个环烯醚萜苷类化合物[10,11]。由此可见，暴马丁香各部位提取物有较优良的药用作用，如抑菌、抗氧化作用等[12-16]。抗氧化剂具有清除自由基的作用，对人体健康有益，广泛应用在食品、药品领域[17,18]。抗氧化剂清除自由基方法中以清除DPPH自由基最为常见[19]。本实验对暴马丁香叶乙醇提取物进行DPPH自由基清除能力和羟基自由基清除能力进行测定，评价了暴马丁香叶乙醇提取物的抗氧化能力，为天然抗氧化剂的开发利用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

2017年7月采自东北林业大学校园，经鉴定为木犀科丁香属，暴马丁香。暴马丁香鲜叶放入烘箱，45℃烘干5 h，制成粉末(≤0.425 mm)，作为供试样品，备用。

没食子酸、福林酚试剂、碳酸钠、邻苯二甲酸氢钾、氢氧化钠、铁氰化钾、三氯化铁、三氯乙酸、二苯基苦基肼自由基(DPPH·)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸亚铁、抗坏血酸(Vc)、水杨酸、无水乙醇，均为分析纯。甲醇，色谱纯。

722型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司。RE-2000A型旋转蒸发仪，巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 GC-MS测定

取样品粉末10 g于圆底烧瓶中，第一次加入60 mL无水乙醇，超声波处理15 min，抽滤，取滤渣加入20 mL无水乙醇，室温静置提取12 h，抽滤，取滤渣加入20 mL无水乙醇室温静置提取24 h，合并滤液，在T=40℃，P=-0.1 MPa，n=35 r/min，进行减压蒸馏浓缩回收乙醇，制得暴马丁香叶乙醇提取物。

将暴马丁香叶乙醇提取物配制成10 mg/L的甲醇溶液，利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪对试样进行测定。色谱条件：HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；FID检测器；初始温度40℃(保持2 min)，以10 ℃/min的升温速率升到280℃(保持2 min)；进样口温度250℃；进样量1.0 μL；不分流，氦气载气，流速1 mL/min。质谱条件：EI电离源，接口温度280℃，离子源温度230℃，电子能量70 eV，扫描范围为30～500 u。

1.3 抗氧化活性测定

1.3.1 样品溶液的配制

称取20 g样品粉末于平底烧瓶中，加入100 mL体积浓度70%的乙醇，超声波辅助提取，功率70 kHz，30℃，40 min。将提取液过滤，滤渣加入100 mL 70%乙醇继续提取，重复两次。将3次提取液合并，在T=50℃，P=-0.1 MPa，n=35 r/min条件下进行减压蒸馏浓缩回收乙醇，得到暴马丁香叶乙醇提取物浸膏。称取1 g暴马丁香叶乙醇提取物浸膏，加入100 mL无水乙醇充分溶解，得到10 mg/mL的样品母液，用移液管准确移取体积为0.5、1、2、2.5、5、10 mL的母液，10 mL容量瓶定容，得到0.5、1、2、2.5、5、10 mg/mL的样品溶液。抗坏血酸为阳性对照。

1.3.2 DPPH自由基清除率测定

DPPH自由基甲醇或乙醇溶液呈深紫红色，当向DPPH自由基溶液中加入自由基清除剂，孤对电子被配对，深紫色的DPPH自由基被还原成黄色DPPH-H非自由基形式，其褪色程度与所接受的电子数量成定量关系，因而可以通过吸光度的变化进行定量分析[18,20-22]。Fenton反应中，检测样品对羟基自由基的清除作用，过氧化氢和铁离子混合产生羟基自由基，在体系内加入水杨酸产生有色物质，该物质在 510 nm 波长处有最大吸收波长[23-24]。按照文献的方法，称取DPPH自由基0.02 g，加入无水乙醇，500 mL容量瓶定容，得到质量浓度为0.04 mg/mL的DPPH自由基溶液。

分别取2 mL不同浓度0.5、1、2、2.5、5、10 mg/mL的样品溶液，加入2 mL DPPH自由基溶液，混合均匀，室温放置30 min后，于517 nm处，测吸光值(A1)，用无水乙醇替代样品溶液测定吸光度(A0)，用无水乙醇替代DPPH自由基溶液测定吸光值(A2)。平行操作3次，样品对DPPH自由基的清除率用以下公式计算：

1.3.3 羟基自由基清除率测定

参考文献[25]的方法，向试管中依次加入1 mmol/L FeSO4溶液1 mL、不同浓度样液1 mL，1 mmol/L H2O21 mL，3 mmol/L水杨酸溶液2 m1混匀，室温下放置30 min，于510 nm波长处测定吸光度(Ax)，用蒸馏水代替水杨酸测定吸光度(A0)，用蒸馏水代替样液测定吸光度(Ax0)。平行操作3次，取平均值。根据下式计算试样对羟基自由基清除率：

1.4 数据处理

采用Excel 2007、SPSS 19.0软件进行数据统计分析、处理，数据均以均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 GC-MS分析

利用超声辅助溶剂提取法，以乙醇作为溶剂，提取得到的暴马丁香叶乙醇提取物为深绿色透明液体，得率为0.1%。暴马丁香叶乙醇提取物的总离子流色谱图，如图1所示。通过面积归一化法计算出各组分的GC含量，共鉴定出12种化合物，暴马丁香叶乙醇提取物的GC-MS分析，如表2所示。

图1 暴马丁香叶乙醇提取物的总离子流色谱图Fig. 1 Total ion current chromatogram of ethanol extracts from leaves of S. reticulata var. amurensis

从表1可知，暴马丁香叶乙醇提取物主要由烷烃类、酯类、醇类、芳香族化合物等组成，GC含量较高的化合物为十一烷(12.38%)、对二甲苯(6.58%)、乙苯(3.72%)、4-O-甲基-d-阿拉伯糖(2.22%)、乙酸丁酯(0.55%)、柏木醇(0.07 %)等，其中十一烷、4-O-甲基-d-阿拉伯糖、乙酸丁酯、柏木醇的质谱图，分别如图2～图5所示。暴马丁香叶乙醇提取物的抗氧化活性组分可能为4-O-甲基-d-阿拉伯糖、乙酸丁酯、柏木醇及其他抗氧化活性组分，有待进一步研究。

表1 暴马丁香叶乙醇提取物的GC-MS分析

图2 十一烷的质谱图Fig. 2 Mass spectrogram of Undecane

图3 4-O-甲基-d-阿拉伯糖的质谱图Fig. 3 Mass spectrogram of 4-O-Methyl-d-arabinose

图4 乙酸丁酯的质谱图Fig. 4 Mass spectrogram of Acetic acid butyl ester

图5 柏木醇的质谱图Fig. 5 Mass spectrogram of Cedrol

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1 DPPH自由基清除率分析

图6为样品的DPPH自由基(DPPH·)清除率。由该图可以看出，暴马丁香叶乙醇提取物对DPPH自由基的清除有较好的作用，且随浓度升高效果增强呈对数增长趋势，暴马丁香叶乙醇提取物浓度较低时，其DPPH自由基清除率随浓度变化较明显，随着浓度增大，当浓度升高到一定程度时，清除率增长趋势渐平缓但仍在升高。在本实验条件下，抗坏血酸清除50% DPPH自由基的浓度(IC50)值为0.001 mg/mL，清除50% DPPH自由基的暴马丁香叶乙醇提取物浓度(IC50)值为0.014 mg/mL。在提取物浓度0.5～10 mg/mL范围内，DPPH自由基清除率最高达94.9%(10 mg/mL)，拟合回归方程y = 3.9042(x) + 86.775(R2=0.9483)，但与抗坏血酸比较，清除力不及抗坏血酸效果明显。要达到较好的抑制效果，提取物所需浓度较大。

图6 样品的DPPH·清除率Fig. 6 DPPH· scavenging rate of samples

2.2.2 羟基自由基清除率分析

图7为样品的羟基自由基(·OH)清除率。由图7可看出，暴马丁香叶乙醇提取物对羟基自由基的清除率随浓度提高而升高呈对数增长模型。在本实验条件下，抗坏血酸清除50%羟基自由基时的浓度(IC50)值为7.082 mg/mL，清除50%羟基自由基的暴马丁香叶乙醇提取物浓度(IC50)值为4.171 mg/mL，本实验条件下，暴马丁香叶乙醇提取物对羟基自由基的半数抑制浓度低于抗坏血酸。质量浓度在0.5～10 mg/mL范围内，清除率最高达72.15%，在浓度较小时，暴马丁香叶乙醇提取物对羟基自由基清除率不高，拟合线性方程为y=20.871(x)+20.441(R2=0.9767)，在本实验浓度条件下暴马丁香叶乙醇提取物总体清除效果优于抗坏血酸，在提取物高浓度时，抗氧化效果较明显。

图7 样品的羟基自由基清除率Fig. 7 Hydroxyl radical scavenging rate of samples

3 结论

采用超声波辅助提取，以乙醇为溶剂，提取暴马丁香叶中有效成分。GC-MS分析结果表明，暴马丁香叶乙醇提取物主要由烷烃类、酯类、醇类、芳香族化合物等组成，GC含量较高的化合物为十一烷(12.38%)、对二甲苯(6.58%)、乙苯(3.72%)、4-O-甲基-d-阿拉伯糖(2.22%)、乙酸丁酯(0.55%)、柏木醇(0.07%)等。暴马丁香叶乙醇提取物的抗氧化活性实验研究结果表明，清除50% DPPH自由基的暴马丁香乙醇提取物浓度(IC50)值为0.014 mg/mL，远高于抗坏血酸；而清除50%羟基自由基的暴马丁香叶乙醇提取物浓度(IC50)值为4.171 mg/mL则低于抗坏血酸。由此可见，暴马丁香叶乙醇提取物对DPPH自由基的清除效果较差，但对羟基自由基的清除效果较好。暴马丁香枝叶繁茂，其叶片数量较多，因此可作为原料提取有效成分，在天然抗氧化剂领域具有开发潜力。