魏媛媛,李伟业,温 晓,于华忠

(吉首大学林产化学加工工程湖南省重点实验室,湖南张家界 427000)

杜仲雄花,雌雄双株,杜仲雄蕊的萌发先于杜仲新枝新叶,避免了在营养供给上与枝叶生长的矛盾,因此,杜仲雄花的营养物质丰富且全面。近几十年,国内外学者对杜仲雄花茶中的天然活性物质和功效作用已进行大量研究。杜仲雄花富含次生代谢产物,主要有总黄酮、木质素类、苯丙素类、环烯醚萜类、三萜、甾类等,具有抗肿瘤、镇静催眠、降血压、降血脂、抗疲劳、抑菌、抗氧化及抗衰老等作用[1-4]。目前市场上杜仲雄花相关产品主要以杜仲雄花茶为主,对杜仲雄花的活性成分不能最大化利用,因此考虑对杜仲雄花进行破壁,从而提高其活性成分的利用率。目前,破壁技术应用广泛,在食品领域的应用范围较小,在中药加工和制药工业方面研究和应用较多,主要以中药破壁饮片和花粉破壁为主。

细胞破壁技术是采用一定的技术手段,破坏细胞外壁和内膜囊都,使其内容物在破壁后渗透而出,从而使有效成分易于被提取或吸收。破壁技术可分为物理法、生物法和化学法。超微粉碎是通过机械对物料的物理作用,将物料粉碎至微米级别。超微粉碎能有效减小物料粉体颗粒粒度,增加粉体的表面积和孔隙率,使超微粉末具有良好的吸附性、溶解性和分散性等多方面的理化新特性[5],有利于方便食品和速溶食品的加工,以满足现代食品生产所需,此外,经超微粉生产的产品更容易被人体消化吸收[6-7]。因此,本研究采用响应面曲线法,以杜仲雄花的破壁率为指标,确定超微粉碎破壁杜仲雄花的最优条件,为杜仲雄花的综合利用提供工艺基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杜仲鲜雄花 2018年3月下旬采自湖南省张家界市慈利县江垭林场,去除鲜叶和枝梗密封袋储存于-10 ℃冰箱冷藏室,保存备用,湖南张家界慈利江垭茶叶合作社提供;芦丁、桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷等标准品 纯度>99%,中国生物制品鉴定院;无水乙醇、甲醇等试剂 均为国产分析纯。

振动式细胞级超微粉碎机 济南达微机械有限公司;Nikon ECLIPSE E200光学显微镜 上海楚柏实验室设备有限公司;Thermo Evolution 220型紫外可见分光光度计 上海辅泽商贸有限公司);Agilent 1260高效液相色谱仪 美国Agilent公司;XD-5200DT型超声波清洗仪 南京先欧仪器制造有限公司;HH型数显电热恒温水浴锅 江苏金坛金城国胜实验仪器厂;Hei-VAP value旋转蒸发仪、SHZ-D(III)循环水式真空泵 巩义市予华仪表有限责任公司;AL204型电子分析天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司;AEL-40SM型半微量天平 南京莱步科技实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 超微粉碎破壁杜仲雄花工艺 低温储存的鲜雄花→真空干燥→粗粉碎→过筛→超微粉碎破壁。

操作要点:

真空干燥:称取低温储存的杜仲鲜雄花36 g,薄层且均匀地摊放在半径为15 cm的不锈钢圆盘中,将其置于真空干燥箱中,在真空度为-0.1 Mpa,温度为40 ℃下,对杜仲雄花鲜花进行干燥[8],间隔搅拌,并测定其水分,控制到实验所需水分含量,备用;

粗粉碎:将真空干燥后的杜仲雄花进行粗粉碎,过100目筛,备用;

超微粉碎破壁:开启超微粉碎机降温系统,设置实验温度值,打开主机预热30 min至机器达到正常运转。称量过100目筛的雄花物料装罐,将物料罐装机后设置粉碎时间,启动粉碎机粉碎系统,粉碎完成后自动停止,取少量破壁后的物料进行破壁率的检测。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 粉碎时间的筛选 取低温冷冻室储存的鲜雄花,真空干燥至水分4%,精密称量100 g,分别粉碎1、2、4、6、8、10 min。通过显微镜下观察其破壁率,得到在最短时间内达到最高破壁率的粉碎时间范围。

1.2.2.2 投料量的筛选 投料量的筛选可根据超微粉碎仪器物料罐的大小和仪器使用注意事项以及雄花破壁率的高低来设定,取处理后超低温冷冻室储存的鲜雄花,真空干燥至水分4%,分别称量100、120、140、160、180、200 g,粉碎6 min。(本实验所用仪器的储料罐的容量小于等于200 g),得到达到最高破壁率的投料量。

1.2.2.3 物料水分的筛选 取低温冷冻室储存的鲜雄花,通过真空干燥控制鲜雄花水分含量,分别干燥至水分含量为2%、4%、6%、8%、10%、12%,精密称取各水分含量的雄花100 g,粉碎6 min。通过显微镜观察其破壁率,得到达到最高破壁率的雄花水分范围。

1.2.3 响应面实验设计 为了使超微粉碎破壁杜仲雄花方法更加科学可靠,根据单因素实验结果,选择粉碎时间、投料量和雄花水分含量为影响因素,雄花破壁率为评价标准,利用Design-Expert 8.0.6软件,根据Box-Behnken中心实验组合设计实验,因素水平设计见表1。

表1 实验因素与水平Table 1 Factors and l evels in response surface test

1.2.4 破壁前后雄花有效成分对比

1.2.4.1 总黄酮含量测定 标准曲线的绘制:称取干燥至恒重的芦丁标准品12.0 mg于100 mL容量瓶中,加适量甲醇,置于40 ℃水浴微热溶解,放冷至室温,加甲醇至刻度,摇匀,即得质量浓度为12 mg·mL-1的芦丁对照品母液,精密量取芦丁对照品溶液1、2、3、4、5、6 mL,分别置于25 mL容量瓶中,各加水至6 mL,采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法进行显色:先加入5%亚硝酸溶液1 mL,混匀,放置6 min;后加入10%硝酸铝溶液1 mL,摇匀,放置6 min;然后加入4%氢氧化钠溶液10 mL,最后加水至刻度,摇匀,放置15 min,测定[9]。以芦丁标准品为横坐标,吸光度值为纵坐标,得芦丁的标准曲线方程为C=0.01185A-0.00333,R2=0.99996。芦丁在4.8～28.8 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。

1.2.4.2 桃叶珊瑚苷、绿原酸和京尼平苷含量测定 色谱条件:Thermal Hypersil BDS C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 um);以0.3%磷酸溶液为流动相A,乙腈为流动相B,按下表1中的规定梯度洗脱,体积流量1.0 mL·min-1;柱温26 ℃;多波长检测:206、238、327 nm;检测时间为25 min,进样量为20 μL。

表2 梯度洗脱条件Table 2 Gradient elution conditions

表3 3种活性成分线性回归方程Table 3 Linear regression equation of Three active ingredients

标准曲线的绘制:分别精密称取桃叶珊瑚苷对照品京尼平苷8.02 mg,绿原酸对照品7.88 mg,京尼平苷对照品4.33 mg,置同一5 mL棕色量瓶中,超纯水定容,摇匀,即得。分别精密吸取混合对照品溶液0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL定容至10 mL容量瓶中,再经0.45 μm微孔膜滤过,依次进样20 μL测定其峰面积。分别以对照品浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标,进行线性回归,得回归方程。回归方程与线性范围见下表3。结果表明,桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷对照品浓度与色谱峰面积线性关系良好。

1.2.5 破壁率的计算 配制4%的花粉液,制作玻片,直接显微镜下观察。

取破壁后的杜仲雄花粉末(超微粉碎破壁和和破壁前相同雄花粉末作为对照)各0.5 g,加入12.5 mL蒸馏水,制作玻片;直接吸取搅拌均匀的破壁处理液,制作玻片;将制作好的玻片置于10×40目的显微镜下观察。每种破壁处理液观察3～4个玻片,每个玻片取3个视野,统计计算[10]。按下式计算花粉的破壁率:

破壁率(%)=视野中已破壁雄花粉末粒数/同视野总雄花粉末颗粒数×100

1.3 数据处理

每组实验重复三次,试验数据使用SPSS Statistics 24软件进行分析,使用wps 2018作图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 粉碎时间对超微粉碎破壁率的影响 由图1可见,超微粉碎时间对其破壁率有一定影响,随粉碎时间的加长,破壁率越高,但2 min后其破壁率差异不大,到8 min破壁率可达100%,粉碎时间越长,超微粉转子与物料的摩擦几率越大,雄花粉碎越彻底[11]。粉碎至6 min左右破壁率基本变化不明显,因此最佳粉碎时间为2～8 min。

图1 不同粉碎时间对雄花破壁率的影响Fig.1 Effect of different grinding time on wall breakingrate of Eucommia ulmoides male flower

2.1.2 投料量对超微粉碎破壁率的影响 超微粉碎投料量的多少与超微粉碎机的性能密不可分[12]。如图2所示,随投料量的增加,破壁率先升高后降低。原料投放量至物料罐的2/3(160 g)处最佳。投料量少于物料罐的1/3(100 g)会对机器转子损伤较大,投料量过多,原料易堆积[13],从而影响雄花粉碎程度,因此超微粉破壁雄花最佳投料量为100～200 g。

图2 不同投料量对雄花破壁率的影响Fig.2 Effect of different dosageon Eucommia ulmoides male flower wall breaking rate

2.1.3 雄花水分含量对超微粉碎破壁率的影响 由图3可见,雄花水分含量对超微粉碎破壁率有一定影响,随雄花水分含量的升高,破壁率呈先升高再降低的趋势。水分含量在3%～9%左右,破壁率达到最大。水分过低或过高,超微粉转子与物料的摩擦力减小,破壁率较低。因此最佳粉碎雄花水分含量为3%～9%左右。物料水分含量越高,由于物料粉碎仓内温度和物料停留时间的影响,使得物料水分不能完全蒸发,且蒸发的水蒸气不能及时排出,必然造成粘转子、粘壁和减小转子摩擦力等现象,不但降低了粉碎效果,而且破坏了物料在粉碎仓内的平衡状态[14]。

图3 雄花不同水分含量对其破壁率的影响Fig.3 Effect of Different Water Contenton Wall Breaking Rate of Eucommia Ulmoides Male Flower

2.2 响应面分析

表5 回归方程方差分析表Table 5 Variance analysis of regression equation

2.2.1 二次多元回归模型分析 响应面实验设计结果见表4。对试验所得的数据进行多元化回归拟合分析得到3个因素与雄花破壁率之间二次回归模拟方程为:

Y=99.44+8.85A-2.17B-3.10C+1.02AB+4.43AC+0.53BC-6.51A2-1.21B2-3.11C2

回归方程显著性检验及方差分析结果见表5。二次回归模拟方程其中一次项和二次项都有显著性影响因素,所以实验各因子对响应值的影响并不是线性关系。

表4 Response surface中心组合方案及响应值Table 4 Response surface central combinationproject and response values

响应面图可以直观地观察各影响因素之间的相互关系,响应曲面图形越陡峭,即其交互作用越显著,图形平稳则说明交互作用比较微弱。两因素交互作用对超微粉破壁杜仲雄花破壁率影响的响应曲面见图3,粉碎时间和雄花水分含量交互作用最强,即对破壁率的影响最为显著;投料量和雄花水分含量交互作用最弱。由图3可见,当粉碎时间为8 min左右,投料量为100 g左右时,超微粉破壁杜仲雄花破壁率达到100%;雄花水分含量在3%左右,粉碎时间为8 min左右,超微粉破壁杜仲雄花破壁率可达100%;雄花水分在3%左右,投料量为100 g左右时,超微粉破壁杜仲雄花雄花破壁率可达100%。

图3 各两因素交互对超微粉破壁杜仲雄花破壁率的影响Fig.3 Effect of interaction of two factors on the wall-breakingrate of ultrafine powder broken Eucommia ulmoides male flowers

图4 杜仲雄花破壁前后显微镜视野图Fig.4 Microscopic field of view of Eucommia ulmoides male flowers before and after wall breaking

2.2.2 最优条件确定以及验证 通过响应曲面法分析得到最大响应值(Y)时,调整后A、B、C对应的值分别为A=8 min,B=100 g,C=6%。为检测响应曲面法所得结果的可靠性,进行验证试验,破壁率为100%,采用优化条件,实验值与预测值相对误差RSD为1.69%。

2.3 超微粉破壁杜仲雄花前后显微镜视野对比

不同破壁方法对雄花细胞破壁方式不同,因此显微镜下视野状态不同。由下图4中超微粉碎破壁雄花显微镜视野图可见,雄花细胞呈碎末状、碎片状等,由此可见超微粉碎破壁是通过物料与介质的混合振动,并受到强烈的振动、冲击、剪贴、撕扯等作用,从而达到破壁效果。

2.4 超微粉破壁杜仲雄花前后有效成分含量对比

杜仲雄花破壁前后提取成分含量对比见表6,由表6可见,破壁后杜仲雄花中的总黄酮、桃叶珊瑚苷、绿原酸和京尼平苷溶出率均明显高于破壁前,破壁后的杜仲雄花总黄酮含量为2.59%,比破壁前高出60%多。由此可见,应用超微粉碎破壁杜仲雄花细胞壁有利于活性成分的溶出。

表6 雄花破壁前后成分对比Table 6 Comparison of components of Eucommia ulmoidesmale flowers before and after wall breaking

3 结论

应用响应面分析法对试验结果和数学模型进行分析,结果显示,回归模型呈现高度显著(P<0.0001),失拟项不显著,可知回归方程的拟合度和可信度均较高,能够很好预测各条件下超微粉破壁杜仲雄花的破壁率。从F值的分析结果可以看出,在所选的各因素水平范围内,粉碎时间对雄花破壁率的影响最大;由响应曲面法分析得到最大响应值(Y)时,破壁条件:粉碎时间8 min,投料量为100 g,雄花水分含量为6%,其破壁率可达100%,验证试验可靠。杜仲雄花破壁前后显微镜视野图表明超微粉具有很好的破壁作用,改善了杜仲雄花细胞壁的通透性,有利于其有效成分的溶出,为杜仲雄花的应用提供可靠依据。