苏来金,叶 剑,刘焕兴2,徐仰丽

(1.温州市农业科学研究院,浙江温州 325006;2.温州市中西医结合医院,浙江温州 325001)

虾类味道鲜美,营养价值极高,深受我国人民喜爱。据2017中国渔业年鉴统计,2016年全国海水养殖虾产量达127万吨,淡水养殖虾产量达203万吨,其中对虾和克氏原鳌虾的年加工量之和超过70万吨[1]。加工过程中会产生约30%～40%的虾头、虾壳等加工副产物,其中含有丰富的蛋白质、矿物质、几丁质等营养物质[2-3]。目前虾头、虾壳等副产品主要以废弃物或者低值饲料的形式处理,造成资源的巨大浪费甚至污染环境。因此合理地开发利用这部分资源,对相关产业附加值提升,促进增收增效具有重要意义。

钙是人体必不可少的元素,膳食中钙营养状况与人体生长发育、心血管疾病以及慢性病密切相关,摄入足量的钙对改善骨质疏松症状具有重要的作用[4-7]。各类调查研究显示,我国居民的钙摄入量偏低[8-10]。食用补钙制剂是改善居民钙营养状况,预防骨质疏松的重要途径。

目前钙剂产品主要分为无机钙、有机酸钙、氨基酸钙、肽钙等类别[11-12]。其中无机钙剂的钙含量高,但溶解性差,生物利用率低;有机酸钙剂溶解性较好,但钙含量低,总体吸收较差;氨基酸钙剂化学稳定性好,能使钙通过氨基酸载体被人体较完整地吸收,但价格昂贵[13]。肽钙是由小肽末端氨基及邻近的肽链与钙形成单环螯合结构,和氨基酸钙相比,具有吸收速度更快,更稳定且不易饱和等优点[12],因此肽钙螯合物近年来已成为补钙制剂的新研究热点。目前相关研究主要是集中在鱼鳞[14]、卵黄[15]、蛋清[16]、大豆[17]等原料,而水解虾壳蛋白制备肽钙螯合物的研究鲜有报道。

本研究以虾壳为原料,以水解度和持钙能力为评价指标,研究了蛋白酶水解制备促钙吸收肽的最佳工艺,为虾壳资源的后续研究和开发利用提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

虾壳 温州市锦达味业食品有限公司;中性蛋白酶(200 U/mg)、木瓜蛋白酶(100 U/mg)、风味蛋白酶(15000 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)、碱性蛋白酶(200 U/mg) 北京索莱宝科技有限公司;甲醛、氢氧化钠、浓盐酸、无水乙醇、氯化钙、钙羧酸指示剂、乙二胺四乙酸 国药集团;试验所用试剂均为分析纯。

AL204电子天平 梅特勒仪器有限公司;PHS-3C型pH计 上海雷磁仪器厂;DF-2集热式恒温加热磁力搅拌器 常州华奥仪器制造有限公司;UNIVERSAL 320R离心机 德国Hettich科学仪器有限公司;WF18超微粉碎机 温州顶历医疗器械有限公司;722型可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 虾壳粉末制备 虾壳经100 ℃热风干燥去除水分后,用超微粉碎机进行粉碎,虾壳粉末置于4 ℃密封保存备用。

1.2.2 氨基酸组成分析 虾壳的氨基酸组成按照GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》[18]的方法进行预处理,采用日立L-8800全自动氨基酸分析仪进行氨基酸组成分析。

1.2.3 酶活力测定 实验用蛋白酶活力测定采用福林酚法[19]。以酪蛋白溶液为底物,在各蛋白酶适宜的条件下每分钟催化酶解酪蛋白产生1 μg酪氨酸所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。酪氨酸浓度(μg/mL)与吸光度的关系为y=0.0103x+0.0024(R2=0.9993)。

1.2.4 酶解工艺 称取适量的虾壳粉,按照物料质量加入一定体积的去离子水,置于磁力搅拌器上,调节溶液pH后按一定比例加入蛋白酶,在蛋白酶最适温度下进行酶解反应。酶解过程中每隔15 min 用3 mol/L HCl或NaOH维持pH稳定。酶解结束后95 ℃灭酶15 min,冷却至室温后调节酶解液pH至7.0,4000 r/min离心15 min。取上清液定容后,于4 ℃保存备用。

1.2.5 水解度测定 采用中性甲醛电位滴定法[20]测定游离氨基氮含量。样品总氮含量采用凯氏定氮法[21]测定。

1.2.6 钙离子结合活性测定 在乙醇等有机溶剂中,螯合钙的溶解度较小,而未螯合的多肽和钙离子可以在溶剂中溶解,因此可以采用乙醇沉淀法将酶解液螯合钙从溶液中分离出来[22]。钙离子结合活性测定按照赵立娜等[16]的方法略加修改,在具塞试管中加入5 mL酶解液、少量5mmol/L的CaCl2和30 mL无水乙醇,充分混匀后在37 ℃温育30 min。然后4 ℃ 8000 r/min离心15 min,弃去上清液。取沉淀加入去离子水溶解,定容后用EDTA络合滴定法检测沉淀中的钙含量[23]。

1.2.7 单因素实验 分别以酶解液的水解度和钙结合量为指标,首先比较碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶在各自的适宜条件下对虾壳蛋白的水解效果,反应条件见表1。再按照碱性蛋白酶酶解基础条件:酶添加量3000 U/g,底物浓度10%,pH10.0,反应温度50 ℃,水解时间4 h,以钙结合量和水解度为评价指标,固定其他变量来分别考察各单因素对水解效果的影响,单因素试验水平表见表2。

表1 五种酶的酶解条件Table 1 Hydrolysis conditions of five kinds of enzymes

表2 酶解单因素试验因素水平表Table 2 Factors and levels of single-factortest for enzymatic hydrolysis

1.2.8 响应面试验 根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理,基于单因素试验结果,以钙结合量为响应值,进行响应面实验确定最佳酶解条件,因素水平表见表3。

表3 响应面分析试验设计因素水平表Table 3 Factors and levels table of response surface design

1.3 数据处理

2 结果与讨论

2.1 虾壳氨基酸组成分析

肽的氨基酸组成及结构会在一定程度上影响其结合钙离子能力,如酪蛋白磷酸肽[24-26]和卵黄磷酸肽[27-29]中富含的磷酸丝氨酸基团被认为与其结合金属离子的能力密切相关。也有研究表明,不含磷酸基团的肽也有钙结合能力[14,30],其中的谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、组氨酸、精氨酸和甘氨酸等在肽与钙结合过程中起着重要作用[31-33]。对虾壳进行氨基酸分析,结果见表4。

表4 虾壳氨基酸组成Table 4 Amino acid composition of shrimp shell

氨基酸组成分析表明,虾壳中蛋氨酸含量最高,其次为谷氨酸和天门冬氨酸,分别占总量的12.3%、12.0%和9.6%。吴长平等[34]利用鳗鱼尾制备钙螯合肽后发现反应中,谷氨酸和天冬氨酸等酸性氨基酸的贡献最大。包小兰[17]的研究也表明,大豆蛋白肽的钙结合活性与肽链中谷氨酸和天冬氨酸含量呈正相关。此外,甘氨酸、亮氨酸、精氨酸等含量也较丰富。因此虾壳蛋白是一种较好的钙离子结合活性肽原料。

2.2 蛋白酶的筛选

通过蛋白酶的酶切作用,可以从蛋白质中释放出具有生物活性的肽类,测定虾壳在各蛋白酶的适宜pH与酶解温度下(表1)所得酶解液的氨基态氮含量和钙离子结合活性,结果见图1。

图1 不同蛋白酶对水解度和钙结合量的影响Fig.1 Effect of different proteases on theDH and calcium-binding amount

由图1可以看出,在碱性蛋白酶作用下,虾壳的水解度最高,且酶解液钙离子结合能力最强,这主要是由于碱性蛋白酶是一种有着宽广作用范围的丝氨酸内肽酶,能够裂解Glu、Met、Leu、Tyr、Lys和Gly的羧端肽键。胰蛋白酶酶解能力与碱性蛋白酶相当,但钙离子的螯合力弱于碱性蛋白酶。综合考虑酶解液的两项指标,选择碱性蛋白酶作为实验的酶解用酶。

2.3 单因素试验

2.3.1 pH对虾壳粉酶解效果的影响 根据碱性蛋白酶的最适pH范围,取pH分别为9.0、9.5、10.0、10.5、11.0进行实验。由图2可知,在该反应体系中,pH大小对产物水解度和钙结合能力均有较显著的影响。这主要是由于碱性蛋白酶有其最适pH,当溶液中pH较低时,会影响酶构象改变,降低酶活力[35]。由图2看出,随反应液pH的升高,样品的水解度和钙结合量都逐步提高,至pH为10.0时趋于平缓。因此,综合考虑选择酶解的pH范围为10.0～11.0。

图2 pH对水解度和钙结合量的影响Fig.2 Effect of pH on the DH and calcium binding amount

2.3.2 酶添加量对虾壳粉酶解效果的影响 由图3可知,当碱性蛋白酶添加量从2500 U/g增加到3500 U/g,样品水解度明显提高,在4000 U/g以上时趋于稳定,说明此时对底物的酶解效果接近饱和。产物对钙离子的结合能力在蛋白酶添加量为4000 U/g时达到峰值,继续增大酶用量反而抑制钙结合量。这说明虽然酶添加量提高可以使虾壳蛋白的水解度提高,但同时也会使酶解液中的钙离子结合活性肽更易被降解为无钙结合能力的游离氨基酸,令其纯度降低。结合两种指标,选择酶添加量为3500～4500 U/g。

图3 酶添加量对水解度和钙结合量的影响Fig.3 Effect of enzyme dosage on theDH and calcium binding amount

2.3.3 酶解时间对虾壳粉酶解效果的影响 由图4可知,反应前期,水解度和钙结合量均明显上升,并在水解5 h时达到最高值。这可能是因为随着水解程度的提高,产物中的多肽含量提高,与钙结合的位点变多,使产物的钙结合能力变强[36]。但5 h后多肽被分解为氨基酸的速度大于多肽产生的速度,因此两项指标均出现下降。结合两种指标,确定酶解时间范围为4～6 h。

图4 酶解时间对水解度和钙结合量的影响Fig.4 Effect of time on theDH and calcium binding amount

2.3.4 酶解温度对虾壳粉酶解效果的影响 反应体系中,温度的提高会加快物质运动速率,特别是底物与酶的接触几率,从而促进反应。但过高的温度也会导致蛋白酶的分子结构的次级键断裂,导致酶活性降低,延缓了酶解进程[37]。从图5中看出,在40～55 ℃的温度范围内,随温度升高,酶解液中的水解度逐渐提高,酶解液的钙离子结合能力也随温度升高而上升。而当温度高于55 ℃,相对高温会使碱性蛋白酶的活性减弱,影响酶解效率。另外,高温也可能导致促钙吸收肽的结构被破坏。虽然产物的水解度变化不大,但钙离子结合能力有所减弱。结合两种指标,确定最佳酶解温度范围在50～60 ℃。

图5 酶解温度对酶解液的水解度和钙结合量的影响Fig.5 Effect of temperature on theDH and calcium binding amount

2.3.5 底物浓度对虾壳粉酶解效果的影响 不同底物浓度对虾壳蛋白水解度和钙结合量的影响见图6。随底物浓度从低到高,底物与酶的接触机会变多,前期样品水解度和钙结合能力不断提高。当底物浓度大于6%,浓度提高反而使水解度降低,且当浓度超过10%时急速下降。而钙结合能力也随底物浓度变大呈现先升高后降低的趋势,在10%达到峰值。可能是由于较高的底物浓度会导致酶解液过于粘稠,令有效的酶切位点减少,影响目标肽的生成[38]。综合两个指标,选择底物浓度为10%。

图6 底物浓度对酶解液的水解度和钙结合量的影响Fig.6 Effect of substrate concentrationonthe DH and calcium binding capacity

2.4 响应面试验分析

2.4.1 响应面试验结果 在单因素实验基础上进行响应面试验对水解条件进行优化,选择pH(A)、酶添加量(B)、酶解时间(C)、酶解温度(D)4个因素,以钙结合量(Y)为响应值,采用Box-Behnken设计实验,根据Design-Expert设计试验方案和结果见表5。通过回归拟合后,得到钙结合量与4个因素之间的回归方程:Y=1.91+0.077A+0.11B+0.12C-0.031D

表5 Box-Behnken实验设计及结果Table 5 Box-Behnken experimental design and results

表6 回归模型方差分析Table 6 Variance analysis for the established native regression model

注:*表示差异显著(P<0.05);**表示差异极显著(P<0.01)。-1×10-2AB-7.5×10-3AC+1×10-2AD+7.5×10-3BC+5×10-3BD+0.032CD-0.11A2-0.24B2-0.16C2-0.095D2。

方差分析结果与显著性检验结果见表6。模型的F值为111.06,P值小于0.0001,表明模型极显著。失拟项的P值大于0.05,表明模型失拟不显著。其中,A、B、C、D、A2、B2、C2、D2的P值小于0.01,差异极显著;CD的P值小于0.05,差异显著。

表7 模型的可信度分析Table 7 The credibility analysis of the model

2.4.2 响应面曲面分析 响应面图和等高线图能直观地反映出各因素间的相互关系及相互作用程度。对于双因素间的交互作用,模型中只有CD(酶解时间-酶解温度)交互作用显著(P<0.05)。根据Design Expert软件得出的回归模型各因素相互之间作用如图7所示。

图7 酶解时间与酶解温度间的交互作用分析Fig.7 The interaction of time and temperature

从图中可以看出,pH和酶添加量一定时,随着酶解时间和温度的升高,酶解液的钙结合能力先升高后降低,在接近中心点时取得最大值。

2.4.3 最佳工艺参数确定及验证试验 以酶解液的钙结合量最大值为指标,经过模型预测,最佳提取条件为:pH10.16,酶添加量4116 U/g,酶解时间5.374 h,酶解温度54.617 ℃,预测的钙结合量可达到1.957 mg/mL。考虑到实际应用,调整验证工艺参数为pH10.2,酶添加量4100 U/g,酶解时间5.5 h,酶解温度55 ℃,在此条件下试验3次。实际测得的酶解液水解度达到16.33%±0.27%,钙结合量平均值为(1.954±0.02) mg/mL,与理论值仅差0.003 mg/mL,说明该模型具有较好的实用价值。

3 结论

本研究以虾壳为原料,研究促钙吸收肽的酶解工艺。通过单因素试验和响应面优化,结合实际生产条件,确定其最佳酶解条件为pH10.2,碱性蛋白酶添加量4100 U/g,酶解时间5.5 h,酶解温度55 ℃,在此条件下酶解液的水解度可达到16.33%,钙结合量达1.954 mg/mL。制备得到的虾壳多肽具有较强的钙离子结合能力,在新型钙制品开发的领域具有较好的前景。