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(1.徐州工程学院食品(生物)工程学院,江苏徐州 221018;2.徐州工程学院江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室,江苏徐州 221018;3.山东省枣庄市市中区环保局环境监测站,山东枣庄 277100)

乳酸菌是发酵类食品中最为常见的微生物之一,在发酵食品的品质形成中具有重要作用。此外,其越来越多的生理功能和特性也逐渐被学者们发现,抗氧化特性就是其中一种。乳酸菌在体外具有类似抗氧化剂的活性,可调节机体胃肠道、降低血清胆固醇、抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生等功效[1]。乳酸菌发酵对食品抗氧化能力的具有提升和改善作用,经乳脂亚种肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroidessubsp.cremoris),詹氏乳酸杆菌(Lactobacillusjensenii)ATCC25258和嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillusacidophilus)ATCC 4356发酵后,发酵蔬菜制品的自由基清除能力、脂质过氧化抑制能力得到了明显的提高[2]。

现有抗氧化特性的乳酸菌主要分离自传统发酵食品、宿主胃肠道系统和自然环境等,具有十分复杂微生态系统的菌相组成[3]。利用体外氧化胁迫耐受(过氧化氢、超氧阴离子等)、脂质过氧化抑制、自由基清除、螯合金属离子、抗氧化酶活力等方法可以评价乳酸菌的抗氧化活性[4-5]。经过分离筛选得到的乳酸菌加入到传统发酵食品中,不仅可以得到抗氧化特性更高的食品,还可以提升发酵食品的优良风味[6]。

中国传统泡菜中含有大量的乳酸菌,四川、新疆等地的泡菜中均具有较高体外抗氧化活性的乳酸菌[7],然而高抗氧化活性的乳酸菌虽然重要,但如果该类型的菌种能够通过肠胃消化系统,定植在人体的肠道中并持续发挥其抗氧化作用,才能真正的实现益生功效。因此,本研究以自然发酵泡菜为原料,筛选具有抗氧化活性及还原活性和亚铁离子螯合能力的菌株,并对其在胃肠模拟消化环境中的表现进行初步探索,以期为抗氧化乳酸菌的肠道定植研究提供基础数据,为后续开发功能性微生态制剂及工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白菜、萝卜、细葱、虾酱、鱼露、等腌制泡菜所用的原辅料 徐州大润发超市;MRS肉汤培养基和革兰氏染色试剂盒 北京陆桥技术有限公司;细菌DNA提取试剂盒、Premix taq聚合酶 大连宝生物工程有限公司;实验所用的化学试剂 均为国产分析纯。

醇美系列腌泡箱 美国Tupperware Brands公司;Mastercycler pro PCR仪、5810 R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司;Experion电泳仪、Molecular Imager® Gel DocTMXR+System凝胶成像系统 美国BioRad公司;400 P拍击式均质器 法国Interscience公司;Synergy 2多功能酶标仪 美国BioTek公司;Bioruptor®UCD200超声波破碎仪 美国Diagenode公司;2.5 L、7 L密封培养罐、厌氧产气袋 日本三菱公司。

1.2 实验方法

1.2.1 泡菜的发酵 选取绿叶白菜均分4瓣,每层叶片涂盐后放入密封箱压实6 h,控净水分;将白糖、辣椒面、虾酱和鱼露汁按照质量以2∶5∶40∶20比例混匀,取萝卜、苹果和鸭梨(5∶1∶1,质量比)洗净切丝混匀;姜和蒜适量去皮切碎,韭菜和细葱分别切成段;上述调料混合拌匀后加入食盐(2%,质量比);均匀铺在每层白菜叶片,放入洁净无油的醇美腌泡箱,用手轻轻压紧,封盖,25 ℃发酵7 d,每日定时排气约1 min。

1.2.2 抗氧化活性乳酸菌初筛 在超净台内称取25 g泡菜(含汤料,按照发酵成品的菜汤质量比)于无菌均质菌袋中,加入1 mol/L,pH7.4的磷酸缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)100 mL置于均质仪拍打15 min;PBS稀释均质液至10-1～10-6倍。将稀释液涂布于含1 mmol/L的终浓度的过氧化氢(H2O2)的MRS固体平板中,放入MGC密封培养罐,37 ℃厌氧条件培养48 h。挑取单菌落进行过氧化氢酶和革兰氏染色实验,革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性的菌落选为初筛菌株。单菌落接种于MRS肉汤培养基,统计可生长的菌落,并作为初筛菌株在已灭菌的MRS甘油保存液中-80 ℃保存。

1.2.3 抗氧化活性乳酸菌菌株复筛

1.2.3.1 菌株细胞悬液和无细胞提取物的制备 参考Lin等[8]的方法,并稍作改进。制备乳酸菌的完整细胞悬液(intactcells,IC):将初筛菌株二次传代培养活化,以1%接种量(v/v)接种于MRS液体培养基中,在37 ℃温度下培养16～18 h,1 mL菌液4 ℃,6000 r/min离心10 min,收集菌体细胞沉淀,用pH7.4的PBS缓冲液洗涤沉淀两次后重悬,调细胞终浓度为109CFU/mL。

获得的IC用超声波破碎仪破碎细胞,280 W,30 s/30 s,10 min冰浴破碎处理。显微镜观察确定破碎完全后,4 ℃ 8000 r/min离心10 min,收集上清液,即为乳酸菌无细胞提取物(intracellular cell-free extracts,CFE)。

1.2.3.2 DPPH·自由基清除能力的测定 参照文献Lin等人[8]的方法对菌株清除DPPH·自由基能力进行测定。分别取800 μL菌株IC、CFE样品与1 mL的新配制DPPH溶液(0.2 mmol/L无水乙醇)于2 mL棕色离心管中混合均匀,室温避光反应30 min后,6000 r/min离心10 min,取上清检测517 nm处的吸光度平行测3次。清除清除能力的测定公式(1)如下:

DPPH自由基清除能力(%)=(1-(A517(sample))/(A517(blank))×100

式(1)

式中:A517(sample)表示样品的吸光度值,A517(blank)表示空白的吸光度值。

1.2.3.3 羟自由基(HO·)清除能力的测定 参考Jeong等[9]的方法,略微的修改。100 μL 5 mmol/L的硫酸亚铁,500 μL去离子水,100 μL水杨酸钠(5 mmol/L无水乙醇)和200 μL菌株的IC、CFE,最后加入100 μL的H2O2(3 mmol/L)制成1 mL反应混合物。37 ℃孵育15 min,510 nm处检测吸光度。数据测3次平行。羟自由基清除能力计算为如下(2):

羟自由基清除能力(%)=(As-Ac)/(Ab-Ac)×100

式(2)

式中:As代表样品的吸光度,Ac表示用去离子水代替样品反应体系仅含有水杨酸钠、硫酸铜和过氧化氢的对照组的吸光度,Ab表示空白溶液的吸光度。

1.2.3.4 还原活性的测定 参照徐爽等[10]的方法,略有修改。各取0.5 mL制备的不同乳酸菌IC、CFE,0.5 mL各浓度的L-半胱氨酸盐酸盐溶液(标准溶液),0.5 mL去离子水(空白)为三组不同反应体系,分别向其中加入0.5 mL PBS(0.02 mol/L)和0.5 mL铁氰化钾溶液(1% m/v)。上述三组反应体系同时置于50 ℃金属水浴锅中水浴20 min后迅速冷却至室温,加入0.5 mL三氯乙酸(TCA,10%),3000 r/min离心5 min,取1.5 mL上清液,加入0.2 mL三氯化铁(0.1%),震荡混匀,室温孵育10 min后在波长700 nm测定反应体系的吸光值。L-半胱氨酸盐酸盐溶液测定标准曲线为Y=683.92X+88.31,R2=0.9981,测定范围50～300 μmol/L。

1.2.3.5 螯合亚铁离子的测定 参考徐爽等[10]的方法,略微修改:0.5 mL乳酸菌无细胞提取物、0.1 mL抗坏血酸(0.1 g/L)、0.1 mL硫酸亚铁溶液(0.04 g/L)和1 mL的NaOH(0.2 mol/L),混合均匀,加入0.2 mL的TCA(10%),37 ℃水浴20 min。3000 r/min离心10 min,上清加0.5 mL邻菲罗啉(1 g/L)反应10 min,测量波长在510 nm的吸光度。

1.2.4 环境耐受性实验

1.2.4.1 酸耐受性 参考黄燕燕等[11]人的方法,略微修改:将上述筛选所得具有较强自由基清除能力的乳酸菌菌株二次活化,5%接种到含酸化至pH3.5的MRS肉汤培养基和非酸化MRS肉汤培养基的96孔细菌培养板中,置于37 ℃下厌氧培养3 h。采用酶标仪(BioTek/USA)测定两组96孔板中细菌生长的情况(OD600 nm)。按照公式(3)计算菌株耐酸性:

耐酸性(%)=OD600 nm(pH3.5)/OD600 nm(pH6.8)×100

式(3)

1.2.4.2 胆盐耐受性 参考黄燕燕等[11]人的方法,二次活化菌株5%接种于含0.3%胆盐的MRS液体培养基中,置于37 ℃下厌氧培养24 h,无胆盐的MRS肉汤培养基为对照组。涂布于平板,37 ℃厌氧培养48 h。按公式(4)计算菌株的胆盐耐受性:

胆盐耐受性(%)=VS/Vb×100

式(4)

式中:VS、Vb分别代表测试样品和对照样品中的活菌数(CFU/mL)。

1.2.4.3 人工胃液和肠液耐受性 取二次活化菌液2 mL,12000 r/min离心2 min,收集菌体,加入2 mL的无菌生理盐水重悬,1%接种于人工模拟胃、肠液和无菌生理盐水中,37 ℃ 180 r/min培养4 h。各取20 μL含菌处理液接种到200 μL的MRS液体培养基中,37 ℃下180 r/min培养8 h,测600 nm处吸光值,按照公式(5)计算存活率,以保加利亚乳杆菌存活率为对照。

存活率(%)=(B/A)×100

式(5)

式中:A、B分别代表生理盐水吸光度值和各处理液吸光度值。

1.2.5 16S rRNA基因序列分析 提取菌株DNA,采用PCR用细菌通用引物(27F,1492R):27F:5′-AGA GTT TGA TCG TGG CTC AG-3′和1492R:3′-GCT TAC CTT GTT ACG ACT T-5′扩增16S rRNA基因。PCR反应体系为:Premix Ex Taq加入10 μL,上下游引物各0.5 μL,ddH2O 8 μL,DNA模板1 μL,总体积20 μL。反应条件:95 ℃预变性5 min,94 ℃变性 30 s,58 ℃引物退火30 s,72 ℃延伸2 min,并冷却至4 ℃保存。扩增产物纯化后送至上海生工进行序列测序,将获得的序列利用BLAST在National Center for Biotechnology Information(NCBI)服务器(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blastn)上进行相似序列的比对。

1.3 数据处理

每个样品设置三个重复,数据用平均值±标准差的形式表示。实验数据处理和图表制作采用Excel 2013软件。

2 结果与分析

2.1 抗氧化活性乳酸菌初筛

H2O2是机体中形成的初始的极性活性氧分子,具有良好的扩散性和持续的作用时间。由于具有良好的体外稳定型,且大量研究表明体外耐受H2O2的乳酸菌也具有潜在的抗氧化能力[12]。为了提高抗氧化活性的菌种的筛选效率,从数量较大的菌株中筛选具有抗氧化性的乳酸菌,本研究以1 mmol/L H2O2为筛选指标,选取在固体平板上可生长的菌落,且为革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性,初步确定75株为具有抗氧化活性的菌株。

2.2 抗氧化活性乳酸菌复筛

首先采用DPPH自由基清除率作为筛选指标进行菌株复筛,对筛选得到的高DPPH·自由基清除能力菌株进行羟自由基清除能力、还原能力和螯合亚铁离子(Fe2+)能力分别进行测定,从而确定各项抗氧化能力均较为突出的菌株。

2.2.1 高DPPH自由基清除能力菌株复筛 利用DPPH自由基清除能力作为菌株抗氧化活性筛查,更为简单、快捷、灵敏且重复性好,是评估抗氧化能力的方法最广泛被使用的。乳酸菌菌株的DPPH自由基清除率(包括DPPH-IC和DPPH-CFE)>30%被认为高DPPH活性乳酸菌[13]。因此,为了优化抗氧化能力乳酸菌的筛选流程,本研究初筛得到的75株乳酸菌菌株IC的DPPH自由基的清除率(DPPH-IC值)。测定的数据进行了排序处理发现:75株乳酸菌菌株的DPPH-IC值范围为2.57%～59.64%之间,在这些菌株中,其中有5株(6.7%)的DPPH-IC自由基清除率超过50%,9株(12%)的DPPH-IC的值在30%～50%,其余61株(81.3%)的DPPH-IC值低于30%。对14株DPPH-IC>30%的菌株进行DPPH-CFE值检测,结果发现,DPPH-CFE值则在10.09%～52.33%的范围内,其中有1株(7.1%)的DPPH-CFE自由基清除率超过50%,3株(21.4%)的DPPH-CFE的值在30%～50%,详情见表1。

本研究中多数菌株的DPPH-IC值明显高于DPPH-CFE值,这与新疆和四川等地的泡菜中分离得到的抗氧化活性乳酸菌的结果保持一致[7]。自制泡菜中乳酸菌的DPPH自由基清除能力整体上较地方传统泡菜中的低,徐爽等从传统发酵食品中筛选得到29株乳酸菌株的DPPH-IC在30%以上[10],但与发酵乳清粉中分离得到的乳酸菌菌株的DPPH自由基清除能力相似[14]。此外,不同种类的乳酸菌其DPPH自由基清除率得到结果也不完全相同,DPPH-IC的范围为43.2%(长双歧杆菌Bifidobacteriumlongum)到52.1%(嗜酸乳杆菌Lactobacillusacidophilus),以及DPPH-CFE的范围为20.8%(B.longum)到41.6%(L.acidophilus)[8]。

表1 初筛得到的14株乳酸菌的菌株信息和DPPH-IC、DPPH-CFE值(IC>30%)Table 1 The information and DPPH-IC,DPPH-CFE value of isolated lactic acid bacteria(IC>30%)

表2 4株乳酸菌菌株的抗氧化能力Table 2 Antioxidant capacities of 4 LAB strains

2.2.2 乳酸菌分离株羟自由基清除能力的测定 羟基自由基被认为是最具有反应活性氧自由基,它可以作用于活细胞中诱导所有生物大分子发生反应而严重损坏细胞,但乳酸菌会在自由基与机体内的发分子发生链式反应,提前终止自由基的生成[15-16]。本实验测定了被认为高DPPH活性乳酸菌(DPPH-IC和DPPH-CFE>30%)的IC和CFE对羟自由基的清除能力。如表2所示,4株高DPPH活性乳酸菌菌株所测定的OH自由基清除率,其IC测定结果的范围为42.58%～80.01%,CFE测定结果的范围为58.66%～89.97%,一般来说,菌株的OH-CFE值高于OH-IC值。在本实验中测定的4株乳酸菌菌株中,Kc13比其他菌株表现出更高的OH-CFE值和OH-IC值,分别是80.01%和89.97%。

其他乳酸菌同样被报道具有显著的清除羟基自由基的能力,且IC和CFE之间的清除能力各有不同。从传统发酵奶中筛选的干酪乳杆菌LactobacilluscaseiSY13 的OH-CFE值为31.19%,德氏乳杆菌LactobacillusdelbrueckiiLJJ的OH-CFE值为10.01%[17]。Ren等[18]测定了9株乳杆菌的无细胞悬液的羟基自由基的清除率的范围在10.37%～94.26%之间,其中菌株CGMCC 1.557 的OH-IC值最高为94.26%,其次是菌株CICC 23174的OH-IC值为73.19%。

在评估乳酸菌菌株对自由基的清除能力包括DPPH自由基和羟基自由基的测定体外实验中,这些表现显著的自由基清除能力的乳酸菌被认为可以下降体外活性氧积累的风险[10]。在本实验中,菌株Kc 1、Kc 6、Kc 8和Kc 13表现出显著的DPPH自由基清除能力和显著的清除羟基自由基的能力,表明这些菌株可以降低体外活性氧积累的风险。

2.2.3 乳酸菌分离株还原能力的测定 有机化合物的还原活性与抗氧化性之间存在着一定的相关性,其还原能力的测定可以作为一个重要的指标用来评价其潜在的抗氧化能力降低功率的化合物[19]。如表2所示,4株乳酸菌菌株所测定的还原能力(reducing activity,RA),其IC测定结果的范围为65.74～214.52 μmol/L cysteine,而CFE测定结果的范围为14.73～66.34 μmol/L cysteine。在这4株乳酸菌菌株中,Kc 13(RA-IC值和RA-CFE值分别是214.52、66.34 μmol/L cysteine),相比其他菌株表现出更高的还原能力,与内蒙古自然泡菜中分离得到乳酸菌结果类似[20]。一般来说,菌株的RA-CFE值高于RA-IC值,而这些还原能力较高的菌种也被证明具保护细胞免受氧化损伤的作用[21]。

2.2.4 乳酸菌分离株螯合亚铁离子(Fe2+)能力的测定 过渡金属离子如Fe2+可以催化活性氧的产生,例如,羟自由基和超氧自由基,这些活性氧又会氧化的不饱和脂肪酸[22]。在很多金属离子都可以催化氧化反应造成机体氧化损伤,其中铁是最丰富并且是最容易与活性氧发生反应,如过氧化氢或超氧阴离子离子与铁离子发生芬顿反应产生羟基自由基[23]。因此,本研究测定了4株乳酸菌菌株的无细胞提取物的螯合亚铁离子的能力的测定结果在8.97～47.31 mg/L范围之间。其中Kc 6菌株表现出显著的螯合亚铁离子能力,达47.31 mg/L。Lin 等[8]测定19株乳酸菌的无细胞提取物的亚铁离子的金属螯合能力,发现2株长双歧杆菌B.longumB6和B.longum15708对亚铁离子螯合量分别为40.7、26.6 mg/L。Lee 等[7]测定了3株短乳酸杆菌对亚铁离子的螯合能力,其范围为1.22～13.6 mg/L。Su等[19]测定了19株酒球菌的亚铁离子螯合能力,其中最高的螯合量为34.66 mg/L。本研究中部分菌株表现出显著的亚铁离子的螯合能力,这可能是乳酸菌的螯合能力与其细胞无细胞提取物中生理螯合剂有关,如乙二胺四乙酸、二乙三胺五乙酸、青霉胺和去铁胺,这些物质可以捕获金属离子,防止氧化反应[24-25]。

2.3 环境耐受性实验

2.3.1 酸和胆盐耐受性 选取上述2株表现出显著的螯合亚铁离子能力的菌株(Kc 6和Kc 13)进行环境耐受性实验,在pH3.5的酸溶液中,Kc 6和Kc 13均可生长,存活率达到71%和89%(见图1)。人进食后胃液的pH在3.0～3.5左右,而益生菌理应具有较高的耐酸性才能随食物通过胃并到达小肠,Kc 6和Kc 13具有较高的耐酸性。

在无胆盐的MRS肉汤培养基中,具有酸耐受性的2株菌株的生长状况良好,菌体浓度可达1.45×108CFU/mL。乳酸菌要到达并定植于肠道,必须对胆盐有一定的耐受性,否则胆盐在细胞外产生高渗透压,对菌体细胞造成影响[11]。0.3%胆盐溶液培养3 h后,2株菌株的菌体浓度依然可维持在60%(菌体浓度在107CFU/mL以上),高于菌体发挥功能特性的活菌数临界值[26]。由此表明,此2株菌株理论上可耐受消化道的高胆盐环境,顺利通过小肠到达大肠,用于进行下步实验。

2.3.2 人工模拟胃液和肠液耐受性 人体胃蛋白酶在酸性环境中被激活,会杀死进入胃中的细菌[27]。人工胃液耐受性结果表明,Kc 6和Kc 13存活率分别为73%和61%;在人工模拟肠液中,Kc 6和Kc 13存活率分别为96%和82%(见图1)。由此可见,Kc 6和Kc 13可耐受人工胃肠液,理论上可定植于肠道,发挥抗氧化等益生功效。

图1 Kc 6和Kc 13的环境耐受性Fig.1 The environmental tolerance of Kc 6 and Kc13

2.4 菌株鉴定

经16S rRNA测序及BLAST比对,2株待测菌株的均隶属于植物乳杆菌Lactobacillusplantarum,相似度达99%。植物乳杆菌在自制发酵果蔬、中国传统泡菜和韩式泡菜中均被检测到做为功能性乳酸菌的存在[7,28]。

3 结论

本研究从自然发酵泡菜中经过氧化氢初筛,DPPH自由基清除活性复筛,羟自由基清除能力、还原活性和二价铁螯合能力的终筛,得到了4株抗氧化能力较高的菌株;经胃肠模拟环境耐受性的检测,最终筛选得到2株理论上可通过胃肠环境定植于肠道的植物乳杆菌(L.plantarum)。本研究对可定植胃肠环境的功能乳酸菌资源开发提供了参考和理论数据,以期提高乳酸菌类产品的市场竞争力。