王龙涛,葛晨霞,高春山,于 鹏,卢怡婷,张 蕾,王建军,李月红

(1.吉林农业大学动物科学技术学院,吉林 长春130118;2.长春科技学院职业技术学院,吉林 长春 130600;3.吉林省水产科学研究院,吉林 长春 130033;4.北京鼎九信息工程研究院有限公司,北京 房山 102488)

中国内陆盐碱水资源丰富,其中西北、东北及华北等内陆地区有较多的高盐碱化湖泊、泡沼等水域,此类水域的水质具有高盐碱、高pH 值、离子系数高、离子比例失调等特点[1]。我国是盐碱水资源较多的国家,且逐年上升,发展以渔业利用为基础的盐碱水渔业,对于缓解水资源危机和改善恶劣盐碱水土生态环境也具有重要意义[2]。水域盐碱浓度的变化与鱼类的生存及生长息息相关,普通淡水类鱼虾难以适应高盐碱水域环境,盐碱度的变化可直接影响鱼类机体血液、血清各项生理生化指标变化或产生氧化应激反应,过高的盐碱浓度会对其机体造成不可逆的损伤。

异育银鲫(Carassius auratus gibelio),异育银鲫属辐鳍鱼纲,鲤形目,鲤科鲫属是以方正银鲫为母本,兴国红鲤为父本人工授精后的雌核发育子代,是我国鲫养殖中的主要品种[3]。本试验选用异育银鲫为研究对象,由于它食性广、生长快、病害少等特点,有取代鲤鱼成为我国非滤食鱼类中第二大淡水养殖鱼类的趋势[4]。由于其对环境的适应性强,目前在广大盐碱地区和海边滩涂池塘中也开始进行规模化养殖[5]。

近年来,盐碱水域养殖技术也已取得较大发展[6],但有关盐碱度变化对水生生物机体胁迫所造成的损伤研究报道还较少。因此,本文通过设置不同浓度梯度的盐碱联合胁迫试验,探讨盐碱水质对异育银鲫的慢性损伤效应,以期为开展盐碱水域养殖鱼类方面提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 所用药品 碳酸氢钠(NaHCO3)、氯化钠(NaCl),购自北京化工厂有限公司,试剂为分析纯(AR 级);超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)试剂盒,均购自北京恒远生物科技有限公司。

1.2 盐碱胁迫试验 试验所用健康异育银鲫120 尾,体重为(29±2)g,由长春市新立城水库提供。采用室内循环水设备进行饲养,水温维持在(25±2)℃,pH 值为7.2～7.4,氨氮含量为0.4～0.5 mg/L,溶氧水平5～7 mg/L。经2 周的驯化饲养后,随机选取健康、个体大小均匀的鲫鱼进行分组试验,为空白对照Ⅰ组和盐碱胁迫Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组,设置NaCl 浓度梯度为0、1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L(分别称0、3.51 g、7.01 g、10.52 g NaCl溶于装有60 L 水的水族缸中);NaHCO3浓度梯度0、15 mmol/L、30 mmol/L、45 mmol/L(分别称0、75.6 g、151.2 g、226.8 g NaHCO3溶于装有60 L 水的水族缸中),每组3 个重复,每个重复10 尾鱼。试验期间盐碱胁迫Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组水体pH 值分别为8.8±0.2、9.5±0.3、10.4±0.2;氨氮含量分别为(0.7±0.1)mg/L、(0.9±0.2)mg/L、(1.2±0.1)mg/L。试验为期6 周,期间每3 d 定时换水,空白对照组换水量约为50%,盐碱胁迫组换水量约为70%。

1.3 样品处理 采用尾椎静脉取血方式采集各组鲫鱼血液,分装于无菌抗凝管及促凝管中,4 ℃暂时保存。在冰盘上剖检鱼收集组织,无菌生理盐水清洗后用滤纸吸干置于无菌EP 管中-80 ℃保存。

1.3.1 血液及血清生理生化指标测定 采用BayerDVIA 120 型血细胞分析仪测定白细胞、红细胞总数、红细胞压积、红细胞平均体积、血红蛋白、平均血红蛋白浓度、血小板。采用贝克曼(ProCX4)全自动生化分析仪器测定谷丙尿素氮(UREA)、血糖(GLU)、碱性磷酸酶(AKP)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、总蛋白(TP)、肌酐(CREA)、白蛋白(ALB)水平。

1.3.2 组织中抗氧化酶的测定 准确称取组织质量后按质量(g)∶体积(mL)=1∶9 的比例加入9 倍体积的生理盐水,剪碎组织并在冰水浴条件下制备匀浆,2 500～3 000 r/min 离心10 min,吸取上清待用。SOD 及CAT 活性测定的具体操作均按南京建成生物工程公司试剂盒说明书进行。

1.4 数据处理及分析 试验鱼存活率和增重率的计算方法如下：存活率=存活尾数/总尾数×100;增重率=(Mt-Mo)/Mo×100;Mt 为试验末鱼体质量,Mo 为试验初鱼体质量。试验所得数据均用平均值±标准误表示,采用IBM SPSS Statistics 20 软件Tukey 单因素分析法进行统计分析。

2 结果

2.1 异育银鲫存活率及增重率 表1 为各组异育银鲫存活率及增重率结果。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组增重率均显著低于Ⅰ组(P＜0.05),其中Ⅳ组为负增重率。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组存活率均为100%,Ⅳ组存活率为70%。

表1 异育银鲫存活率及增重率

2.2 异育银鲫血液生理指标测定结果 表2 为异育银鲫血液各生理指标的测定值。相比于Ⅰ组,Ⅱ组白细胞及血小板数均显著提高(P＜0.05),Ⅲ、Ⅳ组白细胞数显著降低(P＜0.05),Ⅲ组血小板数降低不显著(P＞0.05),Ⅳ组血小板数显著降低(P＜0.05),Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组红细胞平均体积均显著降低(P＜0.05),Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组血红蛋白显著提高(P＜0.05),Ⅱ、Ⅳ组红细胞数显著提高(P＜0.05),Ⅲ组红细胞数提高不显著(P＞0.05),Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组红细胞压积、平均血红蛋白浓度均显著提高(P＜0.05)。

表2 异育银鲫血液生理指标测定值

2.3 异育银鲫血清生化指标测定结果 表3 为异育银鲫血清各生化指标的测定值。相比于Ⅰ组,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组ALT、AST 活性均显著提高(P＜0.05),Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组UREA、GLU、AKP、LDH、TP、ALB 水平均有不同程度提高,其中Ⅱ组UREA、GLU 水平差异不显著(P＞0.05);相比于Ⅰ组,Ⅱ组CREA 水平显著降低(P＜0.05),Ⅲ组CREA 水平降低不显著(P＞0.05),Ⅳ组CREA 水平显著提高(P＜0.05)。

表3 异育银鲫血清生化指标测定值

2.4 异育银鲫肝胰脏SOD 及CAT 活性测定结果各处理组异育银鲫肝胰脏SOD 及CAT 活性[7]变化如下图1 所示,与对照组相比,Ⅱ组SOD 及CAT活性均显著升高(P＜0.05),Ⅲ、Ⅳ组SOD 及CAT活性均显著降低(P＜0.05)。

图1 大肠杆菌生物膜的筛选结果

3 讨论

3.1 盐碱胁迫对异育银鲫血液生理指标的影响水体盐度能够影响鱼类渗透调节功能,导致鱼类机体组织失水、代谢能力下降。碱度对鱼类的损伤效应属于综合致毒效应,碱浓度的变化主要导致鱼类产应激反应,影响机体内环境的稳定性[8]。研究结果表明,在高盐、高碱条件下泌氯细胞调节渗透压耗能较多,导致生长性能减慢,从而影响了幼鱼的生长[8]。通过测定血液生理指标的变化来评估鱼类机体的新陈代谢能力和生理健康水平已被广泛应用[9]。本试验中,盐碱胁迫组异育银鲫红细胞数、红细胞压积、血红蛋白浓度及平均血红蛋白浓度均高于对照组,这可能是由于盐碱胁迫,机体做出的适应性反应而引起应激的产生。张玉等[10]研究发现,盐碱水域鱼类机体与渗透压调节有关的白细胞、红细胞、红细胞压积等指标均显著高于淡水水域中的鱼类,与本试验结果相似。而白细胞数、血小板数随着水体盐碱浓度的升高表现为先升高后降低的趋势,说明高浓度的盐碱水环境对异育银鲫机体造成一定程度的损伤。

3.2 盐碱胁迫对异育银鲫血清生化指标的影响血清生化指标的变化可从侧面反映鱼类机体新陈代谢的状况[11]。CREA 水平用于诊断肾功能状况,其水平的增高多见于各种原因而引起的肾小球滤过功能的减退。最高浓度盐碱胁迫组的CREA 水平显著升高表明异育银鲫肾功能受损。与对照组相比,盐碱胁迫组血清GLU 水平均显著升高,其中Ⅲ、Ⅳ组与对照组相比差异性显著,表明异育银鲫组织细胞的代谢能力下降。蛋白质作为血清中重要的组成成分,在鱼类生理和免疫系统中发挥着重要的作用,血清TP、ALB 主要参与维持机体内血浆胶体渗透压的稳定性,其中TP 还可维持血管内酸碱度的平衡[12]。本试验中,盐碱胁迫组血清TP、ALB 水平均显著高于对照组,表明水体盐碱浓度的升高改变了机体渗透压,刺激机体提高ALB 水平。血清UREA 含量的变化反应了动物体内蛋白质的代谢情况。本试验中各处理组异育银鲫血清UREA 含量均高于对照组,其中高浓度的盐碱胁迫组与对照组差异显著,说明高浓度的盐碱胁迫对异育银鲫机体蛋白质的代谢有显著抑制作用。ALT 和AST 是鱼类机体内重要的氨基转移酶[13],是氨基酸代谢中不可或缺的酶类,其活性的变化不仅反应鱼类氨基酸的代谢状况,而且也从侧面反应出鱼类肝功能的健康状况[14]。本试验中,盐碱胁迫组血清ALT 及AST活性均显著低于对照组,表明异育银鲫肝胰脏的代谢功能受到抑制。LDH 水平的改变直接对机体的能量代谢产生影响,组织病变或受损可引起细胞膜的通透性增加,导致大量LDH 释放至血液中。本试验中,不同浓度盐碱胁迫组异育银鲫血清LDH 水平显著高于对照组,表明其机体受到盐碱胁迫所导致的损伤作用。AKP 参与动物体内营养物质的消化、吸收和运输,而且是动物解毒体系中重要的一部分。本试验中,盐碱胁迫组AKP 水平均显著高于对照组,表明盐碱胁迫对异育银鲫产生的毒性作用刺激机体AKP 水平的提高,从而缓解机体损伤。

3.3 盐碱胁迫对异育银鲫肝胰脏抗氧化酶活力的影响 活性氧自由基(ROS)[15]为动物机体内的一种中间产物,其对维持基因调控、细胞增殖分化及其他生理调节起着不可或缺的作用。盐碱胁迫会导致ROS 的生成量超过机体的负荷量,并累积于肝脏中,造成核酸损伤、蛋白质氧化、脂质过氧化[16]。SOD 及CAT 作为抗氧化防御系统中的关键酶类,通过催化超氧阴离子自由基发生歧化反应或将机体内H2O2还原成水,来实现抗氧化防御减少机体损伤[17]。王卓等[18]将耐盐碱能力较强的青海湖裸鲤暴露32 mmol/L 和64 mmol/L 的盐碱水中,结果发现7 d 内裸鲤肝胰脏SOD 活力表现为先升高后降低的趋势。杨等[19]测定了10 d 内不同浓度盐碱暴露下大鳞鲃肝组织SOD 及CAT 活性变化,结果显示,其活性随着盐碱暴露浓度升高及时间的延长呈现先升高后降低的趋势。本试验也得到相似的结果,相比于对照组,盐碱胁迫Ⅱ组SOD 及CAT 活性显著升高,Ⅲ、Ⅳ组均显著降低。表明低浓度的盐碱胁迫可促使异育银鲫机体产生反馈抵抗机制以应对应激反应,随着盐碱浓度升高,抗氧化酶活性受到抑制,因而对机体造成了氧化损伤。

4 结论

综上试验结果表明,本试验条件下,高盐碱浓度水体能降低异育银鲫的存活、增重,引起鱼体产生慢性损伤,对其健康产生负面影响。