田万年,刘 杰,张馨月,薛书江,贾立军,张守发

(1.吉林农业科技学院动物科技学院,吉林 吉林132101;2.延边大学农学院,吉林 延吉 133002)

牛的卵形巴贝斯虫病(Babesiosis)是由巴贝斯科巴贝斯属的卵形巴贝斯虫(Babesia ovata)寄生于牛红细胞内所引起的寄生虫病。在我国,牛卵形巴贝斯虫病主要传播媒介为长角血蜱,主要分布于我国的河南、四川、甘肃和吉林等省份。该病危害严重,病牛临床症状为高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿,多引起死亡。卵形巴贝斯虫AMA1 基因在侵染宿主细胞中具有介导粘附和入侵宿主细胞的作用,具有较好的反应原性和免疫原性[1]。目前国内尚未见有关牛卵形巴贝斯虫病的重组蛋白与免疫方面研究。鉴于以上情况,本试验对卵形巴贝斯虫AMA1 基因进行克隆和表达,并进行反应原性分析,为进一步建立该病的免疫诊断方法及基因工程疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 血液样本来源 采自吉林省珲春市散养延边黄牛,经血涂片镜检阳性的抗凝血,-20 ℃冰箱保存。卵形巴贝斯虫标准阳性血清、酶标羊抗牛IgG由日本带广畜产大学玄学南教授惠赠。

1.2 主要试剂 pMD18-T 载体、pGEX-4T-1 载体、T4 DNA 连接酶,均购自Promega 公司;E.coliJM109、E.coliBL21、XhoⅠ、EcoRⅠ、TaqDNA 聚合酶、dNTP、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DNA Marker、蛋白质Marker 等,均购自宝生物工程(大连)有限公司。DMEM 为美国Life Technolongies 公司产品。

1.3 引物设计与合成 根据GenBank 上登录的卵形巴贝斯虫AMA1 基因序列(KT312793),利用Primer Premier 5.0 软件设计了1 对特异性引物。上下游引物5′端分别加入EcoRⅠ和XhoⅠ限制性内切酶(下划线部分)。上游引物为5′-ACGAATTCGATACGGCTGTCGGTAGCAA-3′,下游引物为5′-CCGCTCGAGGAGCTGTCACCATTGTCCTTAA-3′。扩增目的片段大小为1 042 bp,引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.4 AMA1 目的基因的克隆 按照全血基因组DNA 提取试剂盒方法提取基因组DNA。以基因组DNA 为模板进行PCR 扩增,PCR 扩增产物经纯化、回收后与克隆载体pMD18-T 连接,转化到E.coliJM109。采用试剂盒方法提取质粒DNA,经PCR 鉴定为阳性的菌液送往上海英骏生物技术有限公司进行测序。

1.5 生物信息学分析 应用互联网在线软件TMHMM2.0 及DNAMAN 软件对克隆的卵形巴贝斯虫AMA1 基因核苷酸、蛋白结构进行分析。

1.6 重组表达载体的构建 分别提取阳性克隆和表达载体pGEX-4T-1 质粒DNA,分别用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切,酶切后产物进行连接,产物转化到E.coliBL21 感受态细胞内,提取质粒DNA,进行PCR 和酶切鉴定。将鉴定为阳性的菌液送往上海英骏生物技术有限公司测序。

1.7 重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE 取经鉴定为阳性的重组菌100 μL 接种到10 mL Amp/LB培养基内,待细菌培养到OD值达到0.6 时,加入终浓度为1 mmol/L 的IPTG 进行诱导表达。将经诱导表达的菌液进行离心,弃上清,用PBS(pH 值7.4)洗涤沉淀2 次,加入5×上样缓冲液、2 mol/L DTT,煮沸5 min,置于-20 ℃备用。按常规方法制备12%分离胶和5%浓缩胶,将处理好的样品取15 μL上样。电泳产物置于考马斯亮兰R250 中染色、脱色,在凝胶成像仪下观察。

1.8 表达产物的Western Blot 分析 将SDSPAGE 电泳凝胶转印到NC 膜上,进行免疫印迹。一抗选用牛卵形巴贝斯虫阳性血清,二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG,在凝胶成像仪下观察结果。

2 结果

2.1 卵形巴贝斯虫AMA1 基因的克隆与鉴定 以基因组DNA 为模板,经PCR 扩增后获得大小约为1 042 bp目的片段,与预期结果相一致(见图1)。将目的基因克隆到pMD18-T 载体上,将阳性菌液进行测序,结果显示,与GenBank 收录的牛卵形巴贝斯虫AMA1 基因(KT312793)同源性为99.8%。

图1 卵形巴贝斯虫PCR 扩增

2.2 生物信息学分析 克隆的卵形巴贝斯虫AMA1 基因经DNAMAN 软件分析,ORF 大小为1 042 bp,编码347 个氨基酸,分子量大小为42 ku。应用TMHMM Server 2.0 软件在线预测显示,该蛋白在膜外的可能性接近于1(见中插彩版图2),推测该蛋白为膜外蛋白,可在大肠杆菌中表达。

2.3 重组表达质粒的鉴定 筛选为阳性的重组pGEX-4T-BoAMA1 质粒为模板进行PCR 鉴定和酶切鉴定。经PCR 扩增后,获得一条约为1 042 bp 的目的片段,与预期的大小相符(见图3);用EcoRⅠ和XhoⅠ对重组质粒进行酶切后,获得约为2 600 bp和1 042 bp 的2 条目的片段(见图4),目的基因片段成功插入到原核表达载体中。

图3 重组质粒pGEX-4T-BoAMA1 的PCR 鉴定

图4 重组质粒pGEX-4T-BoAMA1 的酶切鉴定

2.4 表达产物的SDS-PAGE 分析 表达产物经IPTG 体外诱导后,进行SDS-PAGE 分析,在68 ku 位置处出现表达蛋白带,以pGEX-4T-1 表达的GST 单体蛋白约26 ku,BoAMA1 蛋白约42 ku,二者融合蛋白大小与预期结果相一致(见图5)。而未诱导的对照组未出现表达蛋白条带。表达蛋白主要在沉淀中存在,以包涵体形式。

图5 BoAMA1 蛋白的SDS-PAGE

2.5 表达产物Western Blot 分析 表达蛋白转至NC 膜上后,与牛卵形巴贝斯虫阳性血清反应,在68 ku 处出现一条特异性目的条带(见图6)。表明诱导的蛋白可被牛卵形巴贝斯虫阳性血清识别,具有良好的反应原性。

图6 BoAMA1 蛋白的Western Blot 分析

3 讨论

我国在20 世纪80 年代前,牛的巴贝斯虫种类包括牛巴贝斯虫(B.bovis)和双芽巴贝斯虫(B.bigemina)[2]。白启等从河南牛体内分离到1 株大型巴贝斯虫,后经证实为卵形巴贝斯虫(B.ovata)[3]。目前牛卵形巴贝斯虫病的诊断主要通过临床症状和血液涂片镜检方法,由于染色剂及相似病原体等人为因素影响镜检结果的判定,易出现误差[4]。疫苗是防治卵形巴贝斯虫病最为有效的方法,目前国内尚未研制出牛卵形巴贝斯虫病的疫苗。

AMA1 最早发现于诺氏疟原虫中,AMA1 蛋白在疟原虫侵染宿主细胞中是不可或缺的抗原蛋白,AMA1 是虫体入侵红细胞之前以膜结合形式分泌到虫体表面蛋白[5]。范丽哲研究表明东方巴贝斯虫AMA1 蛋白具有良好的免疫反应原性[6]。国内尚未见对卵形巴贝斯虫AMA1 基因的研究报道。本试验成功克隆了卵形巴贝斯虫AMA1 基因,其片段大小为1 042 bp,其ORF 大小为1 042 bp,编码347 个氨基酸,分子量大小为42 ku。测序分析表明,该基因与GenBank 中登录的卵形巴贝斯虫的核苷酸同源性为99.8%。生物信息学分析预测显示,BoAMA1 蛋白无跨膜区,为膜外蛋白,因此,该蛋白可在大肠杆菌中表达。

体外诱导的BoAMA1 重组蛋白经SDS-PAGE 和Western Blot 分析显示,表达的蛋白主要存在于破碎后的沉淀中,该蛋白以包涵体存在,为不可溶性蛋白。该蛋白能被牛卵形巴贝斯虫阳性血清识别,表明该蛋白具有较好的反应原性,为建立特异、敏感的卵形巴贝斯虫检测方法奠定了基础,并为下一步开发卵形巴贝斯虫病ELISA 诊断试剂盒提供了科学依据。