蒋端凤 莫秋玉 林文远 张国珍 周 琴 陶利英 何玉婵 董 敏

(桂林医学院附属医院血液科，桂林541001)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是一种可引起肝细胞破坏的嗜肝DNA病毒。乙型病毒肝炎是一种全球性传染性疾病，我国乙肝表面抗原携带率高达7.18%，广西是乙肝高发地区，发病率呈逐年增高趋势[1]。免疫性血小板减少症(Immune thrombocytopenia，ITP)，是一种常见自身免疫性出血性疾病，成人年发病率为5/10万～10/10万，60岁以上老年人是该病的高发群体[2]。CD4+CD25+调节性T细胞是1995年由Sakaguchi等[3]首次报道的一类特殊的T细胞亚群，具有免疫抑制性和免疫无反应性，在维持自身耐受、免疫稳态和抑制抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用[4]。研究显示，HBV感染与血小板减少存在相关性，除外ITP本身疾病因素、脾功能亢进、TPO水平降低等引起血小板减少原因外，乙肝病毒感染可能是血小板减少的原因之一[5，6]。乙肝病毒感染相关性血小板减少是指伴HBV感染的ITP，是临床常见血小板减少疾病之一[7]。目前HBV感染相关性血小板减少相关的发病机制尚不明确，国内外相关研究较少。本研究通过检测HBV感染相关性血小板减少患者、HBV感染患者、ITP患者及健康体检者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞比例，探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1临床资料 桂林医学院附属医院2016年11月至2017年11月住院及门诊患者34例，体检中心健康体检者10例。检测HBV表面抗原阴性的10例体检者为正常对照组；参考肝炎病毒相关性血小板减少症诊断标准[8]，纳入HBV感染相关性血小板减少患者12例为实验组；参考ITP诊断标准[2]，且HBV表面抗原及HBV DNA定量检测均为阴性，纳入ITP患者12例为ITP组；纳入的慢性乙型肝炎患者10例为HBV感染组，满足以下条件：符合慢性乙型肝炎诊断标准[9]，未抗病毒治疗，血常规基本正常，无门脉高压、肝硬化、脾大等脾功能亢进的证据。各组临床资料见表1。

1.1.2主要试剂和仪器 FITC标记的鼠抗人CD4单抗、APC标记的鼠抗人CD25单抗及BD FACSTM Lysing Solution(10×)均购自BD Biosciences公司；淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物公司；FACS Calibur流式细胞仪为Becton Dickinson公司。

1.2方法

1.2.1外周血单个核细胞分离 所有研究对象用EDTA抗凝管抽取静脉血2.0 ml，加入PBS液2.0 ml稀释后，用淋巴分离液常规分离获得单个核细胞，加入FACSTM Lysing Solution(10×)悬浮细胞，使细胞浓度调整为1.0×107ml-1。

1.2.2细胞免疫荧光染色 取上述悬浮细胞100 μl，分别加入CD4-FITC、CD25-APC各20 μl，混匀后室温避光孵育15 min；加入PBS液500 μl混匀，1 500 r/min，离心5 min，弃上清。加入0.5 ml PBS充分混匀，悬浮细胞，4 h内流式细胞仪上机检测。

1.2.3流式细胞检测 流式细胞仪上机检测，结果分析应用CellQuest软件，在FSC-SSC散点图上选定淋巴细胞群，在FSC-SSC散点图上选定淋巴细胞群，在淋巴细胞群中以CD4设门选择CD4阳性细胞分析，得出CD4+T淋巴细胞占淋巴细胞百分比。在淋巴细胞群中以CD25设门选择CD25阳性细胞分析，得出CD4+CD25+T淋巴细胞占淋巴细胞百分比。在CD4阳性T淋巴细胞群中，以CD25设门选择CD25阳性细胞分析，得出CD4+CD25+占CD4+T淋巴细胞百分比。

2 结果

2.1实验组与HBV感染组CD4+、CD4+CD25+及CD4+CD25+/CD4+百分比的比较 实验组外周血CD4+CD25+百分比较HBV感染组降低[(4.05±3.70)%比(5.36±1.64)%，P=0.048<0.05]，CD4+百分比也降低[(24.64±9.80)%比(38.42±7.70)%，P=0.004<0.05]，见表2。两组CD4+、CD4+CD25+细胞比例流式检测结果，见图1。

2.2实验组与ITP组、正常对照组CD4+、CD4+CD25+及CD4+CD25+/CD4+百分比的比较 实验组的上述指标较ITP组、正常对照组，差异均无统计学意义(P>0.05)，具体见表3。

2.3HBV感染组、 ITP组与正常对照组CD4+、CD4+

表1 各组患者的临床资料

Tab.1 Clinical characteristics of patients in each group

GroupsFemale/male(n)Age(year)HBV DNA(log10 U/ml)Platelet count(×109 L-1)Normal control group(n=10)7/337.6±15.40228±55.0HBV infection group(n=10)3/748.9±10.73.79±2.34212±54.5ITP group(n=12)11/148.2±21.7032.6±28.5Experimental group(n=12)3/954.6±15.02.94±2.5158.6±26.7

图1 实验组、HBV感染组CD4+、CD4+CD25+细胞比例流式检测结果Fig.1 Results of flow cytometry for CD4+ and CD4+CD25+ cells in experimental group and HBV inf-ection group

表2 实验组与HBV感染组CD4+、CD4+CD25+及CD4+CD25+/CD4+的比较

Tab.2 Comparison of CD4+，CD4+CD25+and CD4+CD25+/CD4+between experimental group and HBV infection group

GroupsnCD4+(%)CD4+CD25+(%)CD4+CD25+/CD4+(%)Experimental group1224.64±9.804.05±3.7014.97±12.0HBV infection group1038.42±7.705.36±1.6414.36±4.70U16.030.047.5P0.0040.0480.410

表3 实验组与ITP组、正常对照组CD4+、CD4+CD25+及CD4+CD25+/CD4+的比较

Tab.3 Comparison of CD4+,CD4+CD25+and CD4+CD25+/CD4+in ITP group，HBV infection group and normal control group

GroupsnCD4+(%)CD4+CD25+(%)CD4+CD25+/CD4+(%)Experimental group1224.64±9.801)4.05±3.701)14.97±12.0ITP group1231.87±12.73.69±2.911.52±6.6Normal control group1031.72±6.63.61±1.211.27±2.8P10.0730.9080.908P20.0750.5750.742

Note:P1.Experimental group vs ITP group；P2.Experimental group vs normal control group.

图2 Treg细胞比例与HBV DNA水平的相关性Fig.2 Correlation between Treg cell proportion and HBV DNA levelNote: r=0.167，P=0.603.

图3 Treg细胞比例与血小板计数的相关性Fig.3 Correlation between proportion of Treg cells and platelet countNote: r=-0.511，P=0.089.

CD25+及CD4+CD25+/CD4+百分比的比较 HBV感染组CD4+CD25+百分比较正常对照组增高[(5.36±1.64)%比(3.61±1.20) %，U=20.0，P=0.023<0.05]，CD4+及CD4+CD25+/CD4+百分比与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；ITP组上述指标与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4相关性分析 在置信区间(双侧)，HBV感染相关性血小板减少患者的Treg细胞比例与HBV DNA水平无明显相关性(r=0.167，P=0.603)，Treg细胞比例与血小板计数存在负相关关系，但差异无统计学意义(r=-0.511，P=0.089)，见图2、3。分析HBV感染患者的Treg细胞比例与HBV DNA水平无明显相关性(r=-0.286，P=0.424)，ITP患者的Treg细胞比例与血小板计数无明显相关性(r=-0.273，P=0.391)。

3 讨论

CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)是免疫系统中的重要组成部分，在正常人群外周中表达率为5%至10%[10]。研究表明Tregs在HBV感染后及慢性乙型肝炎(CHB)患者病程进展中扮演重要角色[11]。CHB患者外周血Tregs水平较正常人明显升高，并同时出现CD4+T、CD8+T细胞数量减少和功能不足，表明Tregs可能通过抑制CD4+和CD8+T细胞的活化和增殖使机体对HBV免疫耐受，引起HBV感染的慢性化[12，13]。研究发现ITP与外周血Tregs缺乏有关，其数量减少和/或功能缺陷与自身免疫性疾病的免疫平衡紊乱和疾病的发生发展密切相关[14，15]。乙肝病毒感染相关性血小板减少症是临床常见病之一，其临床特点既有HBV感染，又符合ITP的诊断，然而发病机制尚不明确。

本研究首次检测了HBV感染相关性血小板减少患者、HBV感染患者、ITP患者及健康对照者的外周血中CD4+CD25+调节性T细胞比例。结果显示，外周血CD4+CD25+T细胞比例在实验组低于HBV感染组，提示HBV感染患者在合并ITP后，CD4+CD25+表达出现下调，与文献ITP发病时Tregs表达降低相符[16]。CD4+CD25+T细胞比例在实验组与正常对照组无明显差异，提示ITP在合并HBV感染后，CD4+CD25+表达出现上调；HBV感染组高于正常对照组，与文献CHB患者Tregs表达升高相符[17]。综上，CD4+CD25+调节性T细胞表达可能受乙肝病毒感染相关免疫耐受与ITP相关免疫调节异常共同的影响。此外，CD4表达率仅在实验组与HBV感染发现差异，可能与各组未以HBV载量比较分析有关[18]。相关性分析结果显示HBV感染相关性血小板减少患者Tregs比例与血小板计数存在负相关关系(r绝对值>0.5)，但无统计学意义(P>0.05)，扩大病例数分析可能会得到有意义的相关性结果。

对于HBV感染相关性血小板减少患者的治疗仍存在许多问题，常遇到血液病医生建议给予抗乙肝病毒治疗，而肝病医生认为未达到指南推荐的抗乙肝病毒治疗指征[9]，会增加费用和停药风险，不应抗病毒治疗。研究表明，抗乙肝病毒治疗后CHB患者外周血Tregs表达水平较治疗前明显下降[19]，ITP患者外周血Tregs表达水平也与治疗效果相关[20，21]。通过联合抗病毒药物及免疫调节药物干预Tregs表达水平，调节机体免疫状态，达到治疗目的。本研究希望可以通过检测外周血Tregs比例为本病的联合抗病毒治疗找到一些依据，结果提示外周血CD4+CD25+T细胞比例减低的本病患者，可能需要联合抗乙肝病毒治疗。但依据并不充分，需要进一步检测比较HBV感染但未达到抗病毒治疗指征患者与本病患者的外周血CD4+CD25+T细胞比例情况，并找出减低的量化标准。

当然本研究也存在一些缺陷，由于符合HBV感染相关性诊断的患者十分少见，研究纳入病例数较少。没有进一步将实验组和ITP组中血小板减少情况进一步细分为初治和复发难治，对结果可能有一定影响，这也可能解释本研究中ITP组Treg比例与正常组无明显差异。此外，Tregs的准确免疫表型还应包括FoxP3、CD127low、CD45RO、CD45RA等[22]，本研究只检测了具有主要调节表型、最常用的CD4+CD25+T细胞，可能未能完全反映一些体现不同功能的Tregs亚群存在的客观差异[23]。Tregs相关细胞因子IL-10、TGF-β、IL-2、IL-12等也需要进一步检测以反映Tregs表达变化及意义[24]。展望未来研究方向，通过进一步增加病例数，检测更准确免疫表型并代表不同功能的Tregs亚群，找到在ITP、CHB、HBV感染相关性血小板减少不同疾病患者中有差异的Tregs亚群，或者能准确反映疾病免疫状态的Tregs相关细胞因子，希望通过检测它们在外周血的量的变化，作为评估疾病病情、疗效及判断预后的指标之一。