姚佳沛 徐建春 刘 炜 樊 凡

(昆明医科大学第一附属医院泌尿外二科,昆明650031)

膀胱癌为常见的恶性肿瘤之一，男性发病率高于女性，考虑男性膀胱癌发病率高除了与吸烟和职业因素有关外，性激素可能是导致男性膀胱癌发病率高的重要原因[1]。研究发现膀胱癌组织中ERβ呈高表达，其表达水平与膀胱癌的发生发展关系密切[2]，如杨典东等[3]研究发现膀胱癌组织中ERβ呈高表达，且与膀胱癌的浸润性进展和分化关系密切。本文对膀胱癌中ERβ的表达水平和沉默ERβ对膀胱癌细胞侵袭、迁移的影响及机制进行研究，从细胞水平探讨ERβ在膀胱癌侵袭、转移中的作用，为膀胱癌的诊治提供依据。

1 材料与方法

1.1材料 收集我院2017年1至12月60例行膀胱癌根治术患者的膀胱癌组织标本及相应的癌旁组织标本，60例膀胱癌患者签署知情同意书，手术前未进行放化疗等治疗。人膀胱癌细胞T24和正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1购自上海中科院细胞库。Matrigel基质胶(美国Sigma公司)，DAB显色试剂盒、免疫组化试剂盒、一抗、二抗(美国Santa Cruz公司)，ERβ及阴性对照siRNA(上海吉玛公司设计合成)等。ERβ siRNA-1干扰序列为5′-GCAAGCATGGAGGAGTGAC-3′，ERβ siRNA-2干扰序列为5′-GGCCTGTGAAACAGTGACC-3′，ERβ siRNA-3干扰序列为5′-GAGGCATTCTCGTCAGATG-3′，对3组ERβ siRNA序列进行预实验，选择最佳RNA组(即ERβ siRNA-3组)作为本研究的ERβ siRNA序列。阴性对照干扰序列为5′-TTCTGGCAAGGTCTCA-CGT-3′。

1.2方法

1.2.1膀胱癌及癌旁组织中ERβ表达测定 将膀胱癌组织和癌旁组织经福尔马林固定，石蜡包埋，切成4 μm厚的切片，采用SP免疫组织化学法测定膀胱癌及癌旁组织中ERβ表达(具体步骤和操作严格按照说明书进行)，以鼠抗人ERβ单克隆抗体为一抗，阴性对照以磷酸盐缓冲液代替一抗，阳性对照用已知乳腺癌ERβ阳性反应片。结果判断：ERβ阳性细胞为细胞核呈淡黄色或棕黄色颗粒，每张切片选择5个高倍视野，计数100个细胞中以ERβ阳性细胞数，取平均值，每100个细胞中ERβ阳性细胞≥10个为阳性，<10个为阴性。

1.2.2膀胱癌细胞和正常膀胱上皮细胞中ERβ表达测定 提取膀胱癌细胞T24和正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1蛋白，BCA法测定T24细胞和SV-HUC-1细胞蛋白浓度，采用Western blot法测定细胞ERβ水平。取细胞蛋白上样进行电泳、转膜、封闭，并孵育一抗及辣根过氧化物标记二抗，以GAPDH为内参，ECL显影，置于暗室中，开启红外灯，将X胶片覆盖PVDF膜条带上，1皿中取出X胶片放入显影液中10 s，清水冲洗，再放入定影液中15 s，清水冲洗、晾干，扫描仪记录保存，采用Quantity one软件测定各蛋白条带灰度值，ERβ相对表达量=ERβ条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

1.2.3ERβ siRNA逆转录病毒载体构建、鉴定、包装 将互补的ERβ siRNA序列、退火Buffer混合，90℃水浴4 min，冷却至室温。用连接酶将pRNAT-H1.4/Retro和退火产物进行连接，连接产物转化至感受态细菌JM109，筛选重组质粒，扩大培养，抽提并纯化质粒，测序重组质粒(华大基因科技公司)证实ERβ siRNA已正确插入逆转录病毒重组质粒(pRNAT-H1.4/Retro)。将重组质粒、PVSV-G载体和DMEM混匀孵育5 min，加入Lipofectamine 2000孵育20 min，然后转移至293包装细胞中培养8 h，更换培养液再培养48 h。荧光显微镜下观察GFP荧光表达证实逆转录病毒重组质粒高效、成功转染到293包装细胞中。

1.2.4T24细胞分组及转染 将T24细胞分为空白对照组、阴性对照组和si-ERβ组，将各组生长良好且达80%以上融合的细胞进行细胞铺板，准备转染。细胞转染前将培养皿中的细胞消化后铺在6孔板中，在24 h内进行细胞转染，转染前1 h更换无抗体培养基，按照Lipofectamine 2000说明书步骤进行细胞转染；空白对照组细胞不转染，阴性对照组细胞转染阴性对照siRNA，si-ERβ组细胞转染ERβ siRNA。转染后利用倒置荧光显微镜观察，发现siRNA转染组细胞中大部分可见明显的绿色荧光，证实已成功转染。流式细胞仪检测发现阴性对照siRNA和ERβ siRNA转染的细胞GFP荧光表达效率分别为72.13%、72.46%。显微镜下观察各组细胞形态变化。

1.2.5转染后各组细胞ERβ和N-cadherin、Vimen-tin、MMP9蛋白水平测定 取各组转染24 h后T24细胞，加入蛋白裂解液裂解细胞，采用Western blot法测定各组细胞ERβ和N-cadherin、Vimentin、MMP9蛋白水平，具体方法同1.2.2。

1.2.6转染后各组细胞侵袭、迁移能力测定 采用细胞划痕实验和Transwell小室测定各组T24细胞侵袭、迁移能力。细胞划痕实验：将各组转染24 h细胞接种到6孔板中(4×105个/孔)，用200 μl枪头划痕，PBS冲洗3次，用含丙酮酸钠和胎牛血清的培养基培养，划痕0 h和24 h对划痕进行拍照观察。Transwell小室测定侵袭能力：将转染24 h后各组细胞用胰蛋白酶消化，终止消化后弃去培养液，用无血清培养基重悬，将细胞密度调整为5×105ml-1。取Matrigel稀释液包被Transwell小室底部膜上室面，使Matrigel聚合成凝胶，取细胞悬液加入Transwell小室，下室加入含FBS的培养基，在培养箱中培养48 h，取出Transwell小室，弃去培养液，甲醇固定，结晶紫染色，棉签擦掉未侵袭细胞，高倍显微镜下观察侵袭细胞数。Transwell小室测定迁移能力：Transwell小室不用Matrigel包被，其他步骤同细胞侵袭实验。结晶紫可将细胞核染成蓝色，显微镜下观察到的蓝色为结晶紫染色的穿膜细胞。

2 结果

2.1ERβ在膀胱癌和癌旁组织中的表达 ERβ阳性细胞呈淡黄色或棕黄色颗粒，位于细胞核中，膀胱癌组织中ERβ阳性率明显高于癌旁组织(P<0.05)。见表1和图1。

2.2ERβ在膀胱癌细胞和正常膀胱上皮细胞中的表达 膀胱癌细胞T24中ERβ相对表达量(0.43±0.08)高于正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1(0.11±0.02)(t=10.976，P<0.001)。见图2、3。

2.3siRNA干扰对T24细胞中ERβ水平的影响

表1 膀胱癌和癌旁组织中ERβ阳性率比较

Tab.1 Positive rate comparison of ERβ between bladder cancer tissues and adjacent tissues

GroupsnERβ positive rateERβ negative rateAdjacent tissues60357Bladder tissues602832χ227.184P<0.001

图1 膀胱癌和癌旁组织中ERβ免疫组化染色(×200)Fig.1 Immunohistochemistry stain of ERβ in bladder cancer and adjacent tissues(×200)Note: A.Bladder tissue；B.Adjacent tissues.

与空白对照组(0.38±0.07)和阴性对照组(0.39±0.06)比较，si-ERβ组T24细胞中ERβ相对表达量(0.08±0.01)降低(t=12.001、14.415，P<0.001)，空白对照组和阴性对照组T24细胞中ERβ相对表达量比较差异无统计学意义(t=0.307，P=0.763)。见图4、5。

2.4沉默ERβ对T24细胞侵袭、迁移的影响 划痕实验：与空白对照组[(59.43±2.64)mm]和阴性对照组[(60.74±2.57)mm]比较，si-ERβ组T24细胞0～24 h二维迁移距离[(25.75±1.83)mm]短(t=29.656、31.369，P<0.001)，空白对照组和阴性对照组T24细胞0～24 h二维迁移距离比较差异无统计学意义(t=1.006，P=0.330)。见图6。

图2 膀胱癌细胞T24和正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1中ERβ表达水平比较Fig.2 Comparison of ERβ expression levels between bladder cancer cell line T24 and normal bladder epithelial cells SV-HUC-1Note: Comparison on two groups，*.P<0.05.

图3 膀胱癌细胞T24和正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1中ERβ的Western blot电泳图Fig.3 Western blot results of ERβ between bladder cancer cell line T24 and normal bladder epithelial cells SV-HUC-1

图4 三组T24细胞中ERβ水平比较Fig.4 ERβ expression levels of cell line T24 in three groupsNote: Compared with blank control group，*.P<0.05;compared with negative control group，#.P<0.05.

与空白对照组和阴性对照组比较，si-ERβ组T24细胞侵袭和迁移能力降低(t=13.814、13.415、14.011、14.316，P<0.001)，空白对照组和阴性对照组T24细胞侵袭和迁移能力比较差异无统计学意义(t=0.157、0.109；P=0.877、0.915)。见表2和图7。

图5 三组T24细胞中ERβ的Western blot电泳图Fig.5 Western blot results of ERβ in cell line T24 in three groupsNote: A.Blank control group；B.Negative control group；C.si-ERβ group.

图6 三组T24细胞划痕实验(×25)Fig.6 Transwell chamber trail on cell line T24 in three groups (×25)Note: A.Blank control group；B.Negative control group；C.si-ERβ group.

表2 三组T24细胞侵袭迁移细胞数比较

Tab.2 Cell amount comparsion of migration cell line T24 in three groups

GroupsnInvasion numberMigration numberBlank control group8412.43±51.25431.64±46.32Negative control group8408.36±52.17429.17±44.27si-ERβ group8135.26±24.371)2)154.25±31.471)2)F101.931119.733P<0.001<0.001

Note:Compared with blank control group,1)P<0.05；compared with negative control group,2)P<0.05.

2.5沉默ERβ对T24细胞形态变化的影响 空白对照组和阴性对照组呈细长的梭形样间充质细胞，si-ERβ组细胞呈紧凑的多边形，类似上皮样细胞特征。见图8。

2.6沉默ERβ对T24细胞中N-cadherin、Vimentin、MMP9蛋白水平的影响 与空白对照组和阴性对照组比较，si-ERβ组T24细胞中N-cadherin、Vimentin、MMP9蛋白水平降低(t=11.024、12.652；9.435、8.050、11.094、11.063，P<0.05)，空白对照组和阴性对照组T24细胞中N-cadherin、Vimentin、MMP9蛋白水平比较差异无统计学意义(t=0.166、0.352、0.551，P=0.870、0.730、0.590)。见表3和图9。

图7 三组T24细胞侵袭迁移能力(×200)Fig.7 Invasion and migration ability of cell line T24 in three groups(×200)Note: A.Blank control group；B.Negative control group;C.si-ERβ group.

图8 三组T24细胞形态学变化(×400)Fig.8 Change on cell line T24 morphology in three groups (×400)Note: A.Blank control group；B.Negative control group;C.si-ERβ group.

表3 三组T24细胞中N-cadherin、Vimentin、MMP9蛋白水平比较

Tab.3 Expression levels of protein N-cadherin，Vimentin and MMP9 in cell line T24 of three groups

GroupsnN-cadherinVimentinMMP9 proteinBlank control80.64±0.130.78±0.160.71±0.15Negative control80.63±0.110.75±0.180.67±0.14si-ERβ80.12±0.031)2)0.21±0.061)2)0.11±0.031)2)F70.98340.09162.809P<0.001<0.001<0.001

Note:Compared with blank control group，1)P<0.05；compared with negative control group，2)P<0.05.

图9 三组T24细胞中N-cadherin、Vimentin、MMP9蛋白Western blot电泳图Fig.9 Western bolt results of protein N-cadherin，Vimentin and MMP9 in cell line T24 of three groupsNote: A.Blank control group；B.Negative control group;C,si-ERβ group.

3 讨论

我国膀胱癌的发病率逐年升高，是泌尿系统常见的恶性肿瘤，对人们的健康造成严重威胁，男性膀胱癌的发病率高于女性，其原因可能与性激素及其受体有关[4]，研究发现ER信号途径与膀胱癌的发生发展关系密切[5]，ER是核受体超家族成员，是有配体激活的转录因子；ER包括ERα和ERβ两种亚型，ERα在膀胱癌组织中表达降低，ERβ在膀胱癌组织中呈高表达[6，7]，因此ERβ在膀胱癌发生发展中的作用受到广大学者的关注，如Nguyen等[8]研究发现ERβ在膀胱癌组织中表达上调，其表达水平与膀胱癌的浸润关系密切；Tan等[9]研究发现ERβ在膀胱癌中高表达，ERβ可作为膀胱癌预后标志物，并有可能成为膀胱癌的治疗靶标；Han等[10]研究发现ERβ是非肌层浸润性膀胱癌的预后标志物，其可抑制钙黏蛋白转换，并可能成为膀胱癌治疗的潜在靶点；Hsu等[11]发现通过ERβ敲除或拮抗剂抑制ERβ信号传导可防止膀胱癌发展。本研究结果发现ERβ在膀胱癌组织及膀胱癌细胞中均呈高表达，和上述研究结果一致，表明ERβ可能参与膀胱癌的发生发展过程。

上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)在肿瘤的发生发展过程中可使上皮肿瘤细胞失去极性，降解细胞和细胞之间的紧密连接结构，使肿瘤细胞骨架发生重组，并获得间质细胞特性，具有间质细胞特性的细胞可引起肿瘤细胞穿过组织基底膜，转移播散到远处器官，促进肿瘤的转移[12-14]。EMT可以引起细胞侵袭、迁移等一系列肿瘤学行为[15]，MMP9为MMP家族成员，可以降解细胞基底膜和细胞外基质，诱导细胞转移，在肿瘤中上调MMP9表达可增强细胞的侵袭、迁移能力[16，17]。RNA干扰技术可以特异性关闭或剔除特定基因的表达，在恶性肿瘤的治疗领域被广泛应用，本文通过RNA干扰技术沉默膀胱癌细胞中ERβ水平，观察其对膀胱癌细胞形态、侵袭、迁移和N-cadherin、Vimentin、MMP9蛋白水平的影响，发现RNA可干扰膀胱癌细胞由细长的梭形样向紧凑的多边形转化，可降低膀胱癌细胞中ERβ水平，沉默ERβ可抑制膀胱癌细胞侵袭、迁移，降低膀胱癌细胞中N-cadherin、Vimentin、MMP9蛋白水平。细长的梭形样为间充质细胞特征形态，紧凑的多边形为类似上皮样细胞特征形态，N-cadherin、Vimentin为EMT过程中的间质标志物，N-cadherin、Vimentin水平下降表明EMT过程受到抑制[18，19]。由此分析沉默ERβ水平可能通过抑制EMT过程抑制膀胱癌细胞的侵袭、迁移。

综上所述，膀胱癌组织中ERβ呈高表达，沉默ERβ水平可抑制膀胱癌的侵袭、迁移，其机制可能与ERβ抑制EMT过程有关。ERβ有望成为治疗膀胱癌的潜在靶点。