孙 瑾 张俊卿 黄延林 杨芳裕 董桂江 田新华

(厦门大学附属中山医院神经外科,厦门361004)

脑胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤，多种治疗胶质瘤传统方法如手术切除、放疗、化疗、伽玛刀，X刀等均不断改进，但总体治疗效果仍不理想，大部分胶质母细胞瘤患者在2年内死亡[1-3]。细胞因子免疫调节治疗作为一种新兴的治疗手段，已在动物和临床实验中证实对肺癌、肝癌、淋巴癌等肿瘤有一定疗效[4]，因此，也为脑胶质瘤的治疗提供了新的方向。在这些细胞因子中,IL-12的研究目前比较全面[5]，IL-12不仅具有在一系列病理、生理变化过程中促进TH1细胞增殖、分化、活化功能，还有促进NK细胞增殖、分化的作用。人体内IL-12可以增加机体抵抗细菌、寄生虫等外来生物侵袭的能力，能促进抗肿瘤免疫，增强机体抗病毒效应。所有功能都与其结构及分子形态紧密相关，IL-12具有约70 kD的异二聚体细胞因子的结构，两条多肽链分别是40 kD(p40)和35 kD(p35)，编码两条链的基因位于两条不同染色体，具有互不相同调节机制。p40基因存在于单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等细胞中表达，p35基因分布则广泛的多，在不同类型的细胞和组织中都有表达，但目前不同亚基IL-12p35的直接作用知之甚少，仍需进一步研究探索。

CRISPR/Cas9自发现之后广泛应用在生物系统和疾病研究中[6]，它是一个简单并且可靠的基因组编辑工具，利用CRISPR/Cas9敲除癌细胞的特定基因，通过检测细胞生物学特性的改变，能够判断该基因对肿瘤的作用，这一方法也被用在脑胶质瘤细胞系的研究中[7]。此次我们通过CRISPR/Cas9系统抑制IL-12p35在大鼠C6细胞上的DNA水平，通过相关分子细胞学检测进一步确定IL-12p35基因敲除的大鼠C6细胞系生长、增殖、迁移和入侵的变化，为下一步研究IL-12的功能提供方向。本文利用CRISPR/Cas9系统构建IL-12p35基因敲除的大鼠C6稳定细胞株，为进一步揭示IL-12p35的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.2方法

1.2.1sgRNA靶点选择及序列合成 选择大鼠IL-12p35基因KO1、KO2、KO3 3个靶点设计及合成sgRNA：应用http://crisprmit.edu/网站设计IL-12p35的sgRNA。设计标准如下:①长20 nt的寡核苷酸sgRNA核心序列按G(N)20NGG序列设计；②正义链模板的5′端加CACC与BbsⅠ酶切后黏性末端互补。sgRNA序列见表1。

1.2.2sgRNA表达慢病毒载体构建 Lenti-sgRNA-EGFP质粒构建:单链DNA oligo两端含酶切位点，经退火处理形成双链DNA，连入Lenti-sgRNA-tag 载体。酶切连接反应体系:Vector plasmid 1 μl，Oligo双链DNA 2 μl，10xBuffer Tango 2 μl，DTT 1 μl，ATP 1 μl，T7 DNA Ligase 0.5 μl，BbsI 1 μl，H2O 11.5 μl，总计20 μl。酶切连接反应条件为:37℃ 5 min，21℃ 5 min，16℃ 30 min共6个循环，4℃保存。

将连接产物转化于DHα感受态细胞中，用含氨苄抗性的LB平板进行筛选，挑取单克隆进行测序鉴定。

1.2.3大鼠IL-12p35基因靶点病毒包装 已经制备Lenti-sgRNA-EGFP质粒、对照病毒和Lenti-CAS9-puro质粒病毒载体(上海吉凯基因)，分别转染293T细胞，培养48 h后收集上清液。在浓缩后293T细胞内进行测定并标定病毒滴度，最终得到1株筛选Cas9稳定细胞株并进行qPCR验证。

1.2.4细胞培养和转换 大鼠C6细胞培养条件为含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基、5%CO2、37℃恒温培养。根据细胞MOI 值加适量病毒，12 h后观察细胞状态，通过比较荧光率来比较各组转染效率，感染3 d后观察GFP表达情况，若荧光率大于80%，将细胞分成两份，分别是12孔培养板中用于RNA提取和6孔板中用于蛋白提取。

1.2.5PCR及TA克隆测序评估基因敲除效果 qPCR检测Lenti-sgRNA-EGFP慢病毒感染细胞，反应条件:95℃预变性30 s；45个循环，95℃变性5 s，60℃退火/延伸30 s；55～95℃熔解曲线分析。

TA克隆测序及Surveyor 法(错配酶法)检测sgRNA 活性:有效靶点的PCR产物切胶回收后构建T载体，蓝白斑筛选，每个靶点随机送测30个左右单克隆测序，软件对测序结果分析，对比靶点有效突变率。KO1靶点共测通30个:其中16个为不同程度的插入缺失，10个无插入缺失突变，3个为空载体，1个无法判定，计算KO1靶点的突变率达到50%以上。混合克隆pool检测PCR反应条件:50 μl PCR体系包括上、下游引物1 μl，2×Taq Plus Master Mix 25 μl，Genomic DNA 2 μl，ddH2O 22 μl，总计 50 μl。反应条件为 95℃ 变性3 min；95℃ 变性30 s，57℃退火45 s，72℃ 延伸105 s，共35个循环；最后72℃ 延伸5 min，4℃保存。取反应后产物5 μl进行琼脂糖凝胶电泳检测。CruiserTM筛选活性sgRNA酶切反应体系:PCR产物3～5 μl，Detecase Buffer 2 μl，Detecase 1.5 μl，加入ddH2O至10 μl，45℃反应20 min后立即向上述10 μl体系内加入2 μl Stop Buffer。sgRNA靶点附近基因组DNA扩增，并进行正向测序，sgRNA位点后区域发现低矮套峰说明基因敲除成功。

榆阳区虽然几十年来在生态建设、水土保持方面取得巨大成效，但整体上的生态系统依然是很脆弱的。因此，在搞好自身生态建设的同时，寻找一条可以让农民稳定收入、持续发展的生态产业化道路，对整个榆林而言，具有非常重要的战略意义。

表1 sgRNA寡核苷酸序列

Tab.1 Synthesized oligonucleotide sequences

PlasmidsgRNA numbersgRNA sequencesPCA00287Sg13′-CGTCCTCACCATGTCGTCCG-5′PCA00288Sg25′-TAAACCACCTCACTTCGGCC-3′PCA00289Sg35′-AAACATTACTCTTGCACTGC-3′

1.2.6Western blot验证靶点有效性 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳使各组酶切后C6蛋白质按分子量从大到小在凝胶中分离，凝胶分成条带蛋白质转移到PVDF膜，一抗IL-12p35(1∶500)与IL-12p35蛋白杂交结合后，用酶标的二抗Rabbit(1∶2 000)杂交结合，X光底片暴光条带显示IL-12p35蛋白，从而对IL-12p35蛋白表达进行定性定量检测。

1.2.7慢病毒感染C6细胞 感染前1天在6-well培养板培养C6胶质瘤细胞，当天按组别(表2)加慢病毒颗粒行C6胶质瘤细胞感染实验。3 d后荧光显微镜观察GFP表达，荧光率达80%以上，继续培养转染成功的C6胶质瘤细胞，以备后续进行细胞增殖及细胞周期检测。

1.2.8MTT检测 将处于对数生长期的IL-12p35基因敲除细胞用胰酶消化后，接种于96孔板中，每组设置3个复孔，待细胞培养至1、2、3、4、5 d后进行细胞增殖检测，按照MTT试剂盒使用说明处理待检细胞，培养箱中孵育4 h后取出，测量490 nm处OD值，计算细胞增殖倍数并绘制曲线。

1.2.9PI-FACS细胞周期检测 胰酶消化各实验组，完全培养基重悬成细胞悬液，5 ml离心管收集细胞，每组设3个复孔。1 300 r/min离心5 min，4℃的D-Hanks洗涤细胞沉淀1次。1 300 r/min离心5 min，4℃预冷75%乙醇固定。1 300 r/min离心5 min 去固定液，D-Hanks洗涤细胞沉淀一次。配制细胞染色液，流式检测，数据分析。

表2 细胞感染分组

Tab.2 Cell infection experiment group and virus dosage

SequenceNameGroupTiter(U/ml)Dosage(μl)PCA00287LV-Il12a-SgRNAKO1×1094.00PCA00024SgRNA-CON244NC1×1094.00

2 结果

2.1重组表达载体Leti-CAS9-puro载体的构建与鉴定 Leti-CAS9载体示意图及sgRNA插入位置如图1所示。正确连接的重组载体测序结果表明，203～224位碱基是sgRNA插入序列，见图1。

2.2sgRNA慢病毒感染细胞3个靶点转染效率的比较 KO1、KO2和KO3荧光率均大于80%，CON、PC组均小于20%，见图2。

2.3PCR检测酶切前后IL-12p35基因表达水平的比较 KO1、KO2均相对于NC表达下调，见图3。

图1 Leti-CAS9载体示意图以及小向导寡核苷酸插入位点Fig.1 Schematic diagram of Leti-CAS9 vector and small guide oligonucleotide insertion site

图2 IL-12p35基因KO1，KO2和KO3 3个靶点sgRNA慢病毒感染细胞比较Fig.2 Comparison of sgRNA lentivirus infection cells from three targets of IL-12p35 gene KO1,KO2 and KO3

图3 Pool PCR检测酶切前后比较Fig.3 Pool PCR comparation before and after enzymecuttingNote: A.PCR(pre enzyme digestion)；B.Cruiser(after enzyme digestion).

图4 TA克隆测序及Surveyor法Fig.4 TA clone sequencing and SurveyorNote: A.Sg1 sequence；B.Sg1.Targeting knockout sequence.

图5 Western blot检测C6细胞，三个靶点及对照组的结果Fig.5 Results of C6 cells,3 targets and control group were detected by Western blot

2.4TA克隆测序及Surveyor法验证基因敲除 sgRNA位点后区域发现低矮套峰说明基因敲除成功，见图4A、B。

2.5Western blot检测 由结果可以看出，KO1和KO2两个靶点均检测出活性。在C6细胞中检测到目的条带，KO1、KO2和KO3均相对于NC表达下调(图5)。

2.6MTT检测 KO组细胞培养至第5天时，细胞增殖倍数小于NC组(P<0.05)，而培养1～4 d时无明显差别(图6)。

2.7细胞周期检测 KO组细胞处于G1、G2/M期的比例为70.36%，高于NC组的65.20%(P<0.05)(图7)。

图6 各组细胞培养1～5 d时增殖倍数的比较Fig.6 Comparison of cell proliferation multiple in each group at 1-5 daysNote: KO group NC group at fifth day,*.P<0.05.

图7 PI-FACS细胞周期检测结果Fig.7 Results of PI-FACS cell cycle detection

3 讨论

基因敲除是通过插入突变及基因靶向技术应用同源重组原理使目的基因丧失功能，CRISPR/Cas9系统利用与同源sgRNA目的基因特异结合基因组DNA形成杂合双链，Cas9这个特定核酸内切酶对这条杂合双链切割并引起DNA双链断裂，诱导产生位点特异性核酸酶，通过错误倾向非同源末端连接修复切断双链，这样修复功能将使断裂位点产生插入或缺失。CRISPR/Cas9具备快速可靠、特异性及敲除效率高等特点，已被广泛应用于基础实验研究。

我们在这个实验中构建由CRISPR/Cas9系统切割而产生Lenti-sgRNA-EGFP质粒的Cas9核酸内切酶基因，并将其转染细胞后，得到可表达细胞的特定核酸内切酶。通过SURVEYOR分析试剂盒我们进行产物多态性分析和特定位点的切割效率检测，通过细胞转染后的基因测序、PCR及Western blot均证实IL-12p35基因敲除成功。MTT通过检测sgRNA病毒感染的细胞组活力来验证IL-12p35基因对细胞增殖的影响，实验发现在第5天细胞增殖倍数明显增加，说明IL-12p35基因在细胞增殖特定时期对C6产生重大影响，与既往黑色素瘤动物实验结果类似[8]。

正常细胞周期是所有细胞生存基本条件，若细胞周期紊乱将引起细胞相关功能调节混乱，从而诱导细胞凋亡甚至癌变。细胞会主动激活不同地方检查点应对DNA损伤，确认基因组完整性及细胞周期正常运转[9]。CRISPR/Cas9系统技术成功筛选出了IL-12p35敲除细胞株，流式细胞检测PI 荧光强度，反映细胞各时相的DNA分布状态，实验检测IL-12p35敲除细胞株的细胞周期进程明显减慢，说明IL-12p35在G2/M期的转化中发挥重要作用。

p35亚基在IL-12种属特性中起决定性作用，IL-12基因修饰肿瘤细胞疫苗用于脑胶质瘤治疗的动物实验研究，很可能取得令人鼓舞的效果，特别是IL-12对抗恶性胶质瘤分泌免疫抑制因子，如TGF-β、PGE-2、IL-10、胰岛素样生长因子[10]，提高胶质瘤抗原的表达，激活CTL、NK特异和非特异免疫杀伤细胞活性。本研究构建IL-12p35基因的CRISPR/Cas9敲除系统，将为后续构建IL-12敲除干细胞和敲除小鼠提供实验依据。