周 萌，柴晓利

(同济大学 环境科学与工程学院，上海 200092)

聚羟基脂肪酸酯(PHAs)是存在于细胞质中被膜包围的直径0.2～0.5 μm的微粒，由于其低水溶性和高分子质量，也是理想的碳能量贮存物质。PHAs的合成需要还原性辅酶I，其来源有两种观点：一是由乙酰辅酶通过三梭酸循环产生[1]，一是细胞内糖原降解产生[2]。其中，第二种观点被广泛接受。PHAs的贮存通常发生在电子供体与受体的来源不稳定的条件下，有碳源储备的细菌相比没有碳源储备的细菌而言，更具竞争优势。最常见的PHAs是聚羟基丁酸酯(PHB)，在能以PHB为碳源的细菌胞内存在PHB水解酶，在这类酶的作用下细菌完成对PHB的降解。许多能利用PHB的细菌也能以硝酸盐作为电子受体，如Comamonadaceae[3],Brevundimonas[4]和Acidovorax[5]等。当营养条件受到限制时，这些细菌就会从以氧气为电子受体转变为以硝酸盐为电子受体。

在反硝化脱氮过程中，硝态氮是电子受体，外加有机碳源是间接电子供体，直接电子供体是有机碳源在细菌体内合成的PHAs。对于内源反硝化，在碳氮比相对较高的环境下PHAs才会积累，因此已有的研究主要关注如何通过改变工艺条件提高PHAs的合成量[6-7]。大部分的反硝化细菌都是兼性厌氧菌，在氧气作为更高效的电子受体存在时，通过直接竞争或是酶的作用抑制反硝化过程。Schulthess和Gujer[8]首次报道了低C/N比进水条件下，反硝化过程中不同价态氮素(硝态氮、亚硝态氮、氧化亚氮)的共存对还原效率具有抑制作用，这是由于异养反硝化细菌可以利用多种胞外碳源作为电子供体，相互之间产生竞争。Pan[9]等人也报道了在反硝化系统中甲醇作唯一碳源，当外界碳源过量时发生了类似的“电子竞争”效应。

在先前的研究中，为探究碳源对微生物生长代谢的影响机理，笔者利用组学手段宏观分析了细菌体内蛋白的变化水平，发现在不同碳源培养条件下，典型反硝化细菌施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)胞内NapA及NapB的蛋白表达量有明显变化，且这两种蛋白质与硝酸盐还原过程息息相关[10-11]。宏蛋白组学可以覆盖到多个代谢途径的蛋白，但对仪器有特殊需求且检测成本较高。为更深入地探究碳源和细菌生长代谢的内在联系，需要进一步验证PHAs对两种蛋白的调控作用，拟通过免疫学手段直接检测细菌体内NapA和NapB的含量。蛋白免疫印迹法是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗原抗体的特异性结合进行检测的方法。经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体如PVDF膜上，能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，和特异性抗体结合，再与标记过的第二抗体起反应，经过底物显色以达到检测的目的[12]。蛋白免疫印迹已被广泛应用于检测蛋白水平的表达，本研究针对已知的蛋白NapA和NapB，选取多肽片段合成抗原，作用于免疫对象使其产生特异性抗体，并将抗体用于施氏假单胞菌胞内目标蛋白检测，旨在建立较为成熟的免疫印迹方法，为进一步研究碳源对微生物生长代谢的影响机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种及其培养条件

实验用菌种(CICC 10428)购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，活化后接种至LB培养基中，于30℃ 160r/min条件下培养。

1.1.2 培养基

对照组培养基A：CH3COONa 10g,KNO32.0g,MgSO4·7H2O 0.2g,KH2PO40.5g,微量元素溶液 2mL,用蒸馏水定容至1L pH值 7.2。实验组培养基B：其他条件不变，将对照组中的10g CH3COONa换成10g PHA。其中微量元素溶液：EDTA 50.0g,ZnSO42.2g,CaCl25.5g,MnCl2·4H2O 5.06g,FeSO4·7H2O 5.0g,CuSO4·5H2O 1.57g,CoCl2·6H2O 1.61g,溶解后用蒸馏水定容至1 L pH值 7.0。

1.2 试验方法

1.2.1 单一碳对照试验

将配置好的培养基A/B分装至250mL锥形瓶中，每个锥形瓶100mL培养液，编号A1/A2/B1/B2，进行高压蒸汽灭菌。取培养至对数期的菌悬液各1mL接种至四个锥形瓶中，于30℃、160 r/min 条件下进行培养。48h后取菌液在4℃ 12000 g条件下离心10min，去除上清液后用PBS清洗三次，每一步完成后经4℃ 12000 g离心5min。将样品放入-80℃冰箱备用。

1.2.2 免疫原的制备与免疫过程

根据蛋白序列选择如下几个肽段进行合成(表1)：

表1 NapA和NapB的抗原合成肽段序列Tab.e 1 Synthetic peptides of NapA and NapB antigen

采用Fmoc固相合成法[13]从多肽的羧基端向氨基端合成得到多肽树脂，用TFA法将多肽从树脂上切割下来，粗提后得到粗品，再经高效液相色谱仪C18反相色谱分离柱分离纯化后冷冻抽干。取纯化后的多肽10mg与血蓝蛋白15mg在缩合剂的催化下进行缩合反应，得到多肽-血蓝蛋白偶联物，即为免疫原。

取四只健康、大小相近的新西兰大白兔Luran、Viran、Blubb和Resan，进行病原菌检疫后，经过一周的观察，兔子皮毛光泽且饮食正常，可进行免疫。免疫原与等量的弗氏完全佐剂(FCA)或弗氏不完全佐剂(FIA)充分乳化后，分别在兔子背部皮内多点注射。免疫程序见表2。最后一次免疫后得到的抗血清，经ProteinA亲和层析柱纯化，得到纯化后抗体lg G。

表2 免疫程序Tab.e 2 Immune schedule

1.2.3 ELISA效价测定

将抗原稀释在包被缓冲液0.1M NaHCO3溶液中，使多肽片段的包被浓度为4 μg/mL。用抗原包被液包被酶联反应板，每孔100 μL，并用塑料薄膜盖住酶联反应板以防溶液挥发，37℃包被2h。包被完成后用ELISA wash buffer(1% NaCl,0.05% Tween 20)清洗反应板3次，每次停留5min，滤纸上拍干备用。在包被好的酶联板中每孔先加入100uL PBST，取第3次免疫后两周的兔抗血清，按1∶11稀释。向第一个孔中加入10 μL稀释后的血清，用枪头轻轻吸取若干次使其混匀。再从第一个孔中吸取10 μL液体到下一个孔中，重复以上操作。最后一孔用免疫前的兔血清做阴性对照，37℃孵育1h并在摇床上振荡10min，用ELISA wash buffer洗涤3次，每次停留5min，拍干。用PBST按1∶20000稀释HRP标记的羊抗兔二抗(Agrisera,AS09 602)，振荡器上孵育30min，再用ELISA wash buffer洗涤。显色剂为TMB显色液(AS15 TMB-HRP)，每孔加入100 μL，然后加入终止反应液，30min内在450nm处读数。

1.2.4 蛋白免疫印迹鉴定

取出-80℃保存的样品，每组加100μL RIPA裂解液，裂解液中已经加入1mM PMSF，以及广谱蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂。超声3次，每次5 s，冰上裂解2 h。4℃ 12000 g高速离心10 min，吸取上清液用于蛋白定量。每孔200μL BCA液与4μL硫酸铜溶液，配制成BCA 蛋白定量工作液使用。37°C恒温下孵育30 min，读取酶标仪读数。根据标准曲线计算样本浓度，并最终将浓度调整为2μg/μL。

根据目的蛋白的分子量，配制10%和15%的分离胶，浓缩胶为5%。样品中加入5X loading buffer，充分混匀后，沸水浴10min，使蛋白质变性。电泳条件：浓缩胶恒压90V约20min；分离胶恒压160V，通过预染蛋白Marker来确定电泳停止时间。电泳时两块凝胶同时进行，其中一块凝胶用来考马斯亮蓝染色，确保蛋白质分离。采用湿转法转膜：300mA恒流，0.45μm孔径PVDF膜，转膜时间60min。转膜完成后，用丽春红染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。然后将膜浸没在5% BSA-TBST中室温下轻摇60min。弃去封闭液，用TBST清洗5次，每次3min。用5% BSA-TBST稀释一抗，室温孵育15min，放4℃过夜。倒掉一抗稀释液，TBST洗5次，每次3min。用5% NFDM-TBST稀释二抗，加入识别对应一抗的HRP标记二抗，

1∶5000稀释，室温轻摇40mins。ECL加到膜上后反应3～5min，胶片曝光10s到5min(曝光时间随不同光强度而调整)，显影2min，定影。

2 结果与分析

2.1 抗体效价检测结果

图1 抗NapA的血清效价

Fig.1 Serum titer of anti-NapA antibody

图2 抗NapB的血清效价Fig.2 Serum titer of anti-NapB antibody

用合成的多肽作为包被源，包被浓度4 μg/mL，四只小鼠第三次免疫后两周的血清按照1∶121，1∶1331，1∶14641，1∶161051的比例稀释。根据ELISA结果对其效价进行分析，对NapA，Luran和Virkat产生的血清多抗效价为1∶14000(图1)，而对NapB，Blubb产生的血清多抗效价为1∶160000，Resan产生的血清多抗效价更高大于1∶160000(图2)。

2.2 蛋白免疫印迹结果

图3 菌体内蛋白的SDS-PAGE结果

Fig.3 SDS-PAGE of proteins extracted from strains

图4 菌体内蛋白的Western Blotting分析Fig.4 Western Blotting of proteins extracted from strains

SDA-PAGE结果如图3所示，各组样品都有明显分离，且在低蛋白分子量区域更为明显。对菌体内提取的总蛋白进行免疫印迹分析，与合成的NapA及NapB抗体进行反应，实验结果表明在四组样品中在30-40KDa附近的条带清晰可见且较为整齐，在100KDa和15KDa附近也出现了明显的反应带(图4)。

3 讨论

本研究选取三个片段进行多肽合成，制备了免疫原，并通过免疫兔子获得了NapA和NapB蛋白的多克隆抗体。免疫效果的好坏对抗体制备及后续免疫印迹分析可靠性有直接影响，故需要一系列的验证试验。ELISA检测结果表明，制备的NapA和NapB免疫抗原均能够针对实验兔子产生良好的免疫效果。NapB免疫原效果甚佳，血清效价大于1∶160000，NapA免疫原的效价也可以达到1∶14000。

与单克隆抗体不同，多克隆抗体无法进行敏感性分析，效价相对较低的抗体在免疫印迹分析中可能也会对目标蛋白产生敏感可靠的反应[14]。选取Virkat和Blubb产生的抗血清进行后续Western Blot实验，根据KEGG数据库，目标蛋白NapA和NapB的理论蛋白质分子量分别约为93KDa和16KDa，所选的内参蛋白GADPH为糖酵解过程中的关键酶，检测条带一般为36KDa[15]。本研究中的内参条带清晰且整齐，在目标条带区域也可以看到明显反应带，说明制备出的抗体可针对NapA或NapB进行免疫印迹分析。

一般而言内参蛋白在同种细胞内蛋白质表达量一般恒定且不受诱导物质影响，若对蛋白条带进行灰度分析，可通过内参蛋白实现半定量。后续试验中将改变施氏假单胞菌培养过程中的碳源条件，进一步测定NapA及NapB的含量变化，探究其内在联系。

4 结论

本研究中制备的多克隆抗体具有良好的免疫性能，可用于检测施氏假单胞菌胞内的NapA及NapB蛋白，特异性强且成本相对较低。选取GADPH作为内参蛋白，后续研究改变实验条件，还可通过灰度分析进行半定量。