费洁羽，杨凌杰，廖晨茜，何丽娜，陈志豪，王石磊

(浙江树人大学 生物与环境工程学院,浙江 杭州 310015)

黄酮类化合物是一类常见的次生代谢产物，具有抗癌、抗氧化、抗炎、降低血脂和高血压、改善血管脆性和通透性、预防冠心病和心绞痛等多种药理活性，在药品开发和保健食品开发中具有广泛的应用价值[1-2]。黄酮大多数与糖结合，以黄酮苷的形式存在，少量以游离态存在。黄酮提取方法主要有溶剂回流提取法、大孔吸附树脂法、超声波或微波辅助提取法、超临界流体提取法、酶解法等[3]。目前关于黄酮的提取已有较多研究，但灵芝中黄酮的提取研究目前仍较少。竹灵芝是一种喜热灵芝(Ganoderma calidophilum)[4]，生长于云南、海南等地，竹灵芝中黄酮含量的相关研究则更少。超声波能够破坏细胞壁并增大溶剂向细胞的渗透量，有利于目标提取成分的溶出，且超声波的热效应可使溶剂和原料组织温度升高，提高目标提取成分的溶出，加快提取。超声波辅助提取具有提取效率高、提取时间短、适用性广、操作简单等优点，在天然产物的提取中应用广泛[5]。本文主要研究超声波辅助下的竹灵芝中黄酮的提取。

1 材料与仪器

无水乙醇、NaNO2、NaOH、Al(NO3)3(以上均为分析纯试剂)，芦丁(纯度98%，阿拉丁)，竹灵芝(市售，采于云南文山)、容量瓶，电子分析天平，紫外分光光度计(日本岛津UV-124型)，超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2 实验方法

2.1 标准曲线的建立

准确称取于芦丁标准品100 mg，用50 %乙醇溶解并定容至100 mL，得到浓度为1 mg/mL的芦丁标准溶液。分别精密吸取芦丁标准品溶液0 ，0.2，0.4，0.6 ，0.8，1.0 mL于25 mL容量瓶中，加入1.0 mL 5 % NaNO2溶液，摇匀静置5 min后再加入1.0 mL 10 % Al(NO3)3溶液，摇匀，放置5 min后加人10 mL 4% NaOH溶液，用50 %乙醇定容。以50 %乙醇为空白对照，在波长510 nm处测定标准样的吸光度，得到芦丁质量浓度(mg/mL)与吸光度之间的标准曲线。

2.2 竹灵芝中总黄酮的提取工艺优化

2.2.1 料液比对灵芝黄酮得率的影响

精密称取5份待测灵芝样品，每份1 g，置锥形瓶中，加入乙醇浓度50 %、料液比分别为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60的乙醇，在60 ℃温度下超声提取40 min。过滤上清液，将滤液置于100 mL容量瓶中，用50 %乙醇定容。

将5种提取条件下得到的灵芝滤液分别取1.0 mL于25 mL容量瓶中，加入1.0 mL 5 % NaNO2溶液，摇匀静置5 min后再加入1.0 mL 10 % Al(NO3)3溶液，摇匀，放置5 min后加人10 mL 4 % NaOH溶液，用50 %乙醇定容。以50 %乙醇为空白对照，在波长510 nm处测定标准样的吸光度，通过标准曲线转换计算即可。

2.2.2 超声时间对灵芝黄酮得率的影响

精密称取6份待测灵芝样品，每份1 g，置锥形瓶中，加入浓度50 %、料液比为1∶40的乙醇，在60 ℃下，分别在提取时间20,30,40,50,60,70 min的条件下超声提取。后续操作同“2.2.1”所述方法，计算黄酮的提取得率。

2.2.3 乙醇浓度对灵芝黄酮得率的影响

精密称取4份待测灵芝样品，每份1 g，置锥形瓶中，分别加入料液比1∶40的50%，60%，70%，80%乙醇，在60 ℃下超声提取50 min。后续操作同“2.2.1”所述方法，计算黄酮的提取得率。

2.2.4 超声温度对灵芝黄酮得率的影响

精密称取4份待测灵芝样品，每份1 g，置锥形瓶中，加入料液比1∶40，浓度70 %的乙醇，分别在40，50，60，70 ℃条件下超声提取50 min。后续操作同“2.2.1”所述方法，随后计算各实验条件下黄酮的提取得率。

2.2.5 正交实验

根据单因素试验结果，把料液比、超声时间、乙醇浓度、超声温度为自变量，灵芝黄酮得率为评价指标，根据L9(34)的正交设计表进行优化实验。筛选出最优提取条件，并利用该方案进行三次提取，验证方法的稳定性

3 结果和分析

3.1 芦丁标准曲线

将吸光度对芦丁溶液的浓度进行线性回归分析，得回归方程y = 0.4527x - 0.0007，R2= 0.9998，表明在该范围内具有良好的线性关系。实验结果见表1和图1。

表1 芦丁浓度与吸光度之间的关系Tab.1 relationship between the concentration of luding and the absorbance

图1 芦丁标准曲线

Fig.1 Relationship between rutin concentration and the absorbance

3.2 竹灵芝中总黄酮的提取工艺优化

3.2.1 料液比对灵芝黄酮得率的影响

不同料液比下灵芝黄酮得率如图2所示，由图2可知，在料液比低于 1∶40 时，提取用液增加使灵芝黄酮得率也随之增加，当料液比超过1∶40 后，总黄酮提取得率增加缓慢。

图2 不同提取条件与灵芝总黄酮得率之间的关系

Fig.2 the extraction yield of total flavonoids under different extraction conditions

3.2.2 超声时间对灵芝黄酮得率的影响

不同超声时间下灵芝黄酮得率如图2所示。实验表明：超声时间为50 min时，灵芝中黄酮提取得率最高，为6.086 mg/g；当超声时间未达到50 min 时，超声时间越久，灵芝中黄酮的得率越大，可以得出一定时间的超声波处理有利于灵芝中黄酮类化合物的提取的结论；但当超声时间超过50 min 后，灵芝中黄酮得率反而降低，但下降的幅度并不太大，这可能是由于超声时间过长，导致灵芝中黄酮类成分被破坏，从而降低提取得率。

3.2.3 乙醇浓度对灵芝黄酮得率的影响

由图2可知，当乙醇浓度小于70 %时，随着乙醇浓度的增加会使灵芝中黄酮的得率也随之上升，当乙醇浓度大于70 %时，黄酮类化合物的得率随着乙醇浓度的增加而呈现下降的趋势。原因可能是因为乙醇浓度不同，其极性也不相同，而黄酮类化合物有很大的极性范围，可以推断出当乙醇浓度为70 %时，它的极性可能与灵芝中黄酮类化合物的极性最为相似，所以在70 %的乙醇浓度下是最适合竹灵芝中黄酮的提取条件。

3.2.4 超声温度对灵芝黄酮得率的影响

实验表明：提取率随着超声温度的提高而提高，达到60 ℃最大。可能是由于随着超声波的温度升高，分子运动才变得更加激烈，从而加快了灵芝中黄酮成分的扩散，促进了有效成分在试剂中的溶出，有利于黄酮类化合物的浸出。

3.2.5 正交实验

选择了料液比(A)、超声时间(B)、乙醇浓度(C)、超声温度(D)四个因素进行单因素实验，初步确定各因素的较优条件，再采用L9(34)正交表进行正交实验，进一步优化提取工艺。通过正交实验研究了各因素对提取率的影响，确定了各影响因素的先后顺序为A>C>D>B，即料液比的影响最明显，其次是乙醇浓度，然后是超声温度，最后是超声时间。通过正交实验确定超声波法提取灵芝中黄酮含量的最佳工艺条件为A3B3C2D1，即最优的提取条件为料液比1∶50，超声时间60 min，乙醇浓度70 %，超声温度50 ℃。

表2 试验因素水平Tab.2 Factor level of orthogonal experiment

表3 正交试验设计表及结果Tab.3 Orthogonal experiment chart and result

3.3 验证实验

根据上述实验，利用正交试验得出的最佳提取条件对灵芝中的黄酮进行提取，平行进行三次实验，三次实验的得率结果分别为:7.275，7.268，7.264，平均值为7.269 mg/g。从三次测定的灵芝黄酮得率可以看出，正交设计的得出的最佳提取方案，提取率较高，且具有较好的重现性和稳定性。

4 结论

(1)以芦丁为标准物质，在浓度0～1.0 mg/mL范围内反应物与吸光度之间的线性关系较好。

(2)从竹灵芝中提取总黄酮时，总黄酮的得率随着提取溶剂的增加，逐渐增加，当提取溶剂超过40倍时，随着提取溶剂的增加，黄酮得率的增加很缓慢；黄酮得率随着超声时间的增加先升高再降低，在50 min时有最高提取得率；乙醇浓度增加，黄酮提取得率先增加后减少，在70%乙醇浓度时有最高的提取得率；随着超声时间的增加，黄酮得率逐渐提高，到60min后，黄酮得率增加不再明显甚至有所下降。

(3)通过正交试验，发现利用乙醇溶液对灵芝中的黄酮进行提取时，各因素对实验结果的影响顺序依次为料液比>乙醇浓度>超声温度>超声时间，最优的提取条件为料液比1∶50，超声时间60 min，乙醇浓度70 %，超声温度50 ℃，在该条件下对灵芝中的黄酮进行提取有最高的提取得率，提取得率约为每1g竹灵芝中可提取得7.27mg的总黄酮。