陈福涛 钟富宽 白巧红 卞光荣 杨飏 朱江

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种可以预防和治疗的呼吸系统疾病,伴有明显的肺外效应。COPD主要表现为肺部不完全可逆性的气流受限,同时气流的受限通常是渐进的,其程度往往与肺部对有害颗粒或气体的炎症反应密切相关[1-2]。目前,COPD仍然是一项全球性的公共健康问题:在美国,COPD位居慢性致死致残性疾病第4位;另据一项世界卫生组织(World Health Organization,WHO)和世界银行联合发布的研究推断:到2020年COPD所带来的社会负担将跃居全球疾病负担的第5位。因此,早发现早治疗,对于改善COPD患者的预后十分重要。然而,严重威胁着人类健康的COPD在早期仅表现为生物化学和细胞水平事件且无明显临床症状,因此,其早期诊断比较困难。寻找新型、有效的分子标志物和治疗靶点对于其临床诊断和治疗具有重要的意义。

近年来,非编码核糖核酸(non-coding ribonucleic acid,ncRNA)在疾病发病机制领域的研究不断升温,且研究内容越来越深入。其中,作为新型ncRNA的环状核糖核酸(circular ribonucleic acid,circRNA),因其独特的性质和丰富的功能,成为目前疾病分子机制研究中的新宠。随着RNA测序和生物信息学等技术的发展,circRNA被发现大量存在于真核细胞中并参与基因的转录后调控,还可通过微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)海绵作用来调控基因的表达,从而在疾病的发生和发展中发挥重要作用[3]。作为ncRNA的一种,miRNA与多种疾病的关联性已经得到了广泛研究,关于COPD的研究也逐渐增加。目前,越来越多的文献报道了miRNA的异常表达与COPD的发生发展相关[5]。尽管关于circRNA与COPD的研究甚少,但考虑到miRNA在气道炎症性疾病中的意义以及circRNA作为miRNA海绵的作用,circRNA有望成为COPD临床诊断和预后判断的新兴生物分子标志物,并将对疾病的治疗策略提供新的研究思路。因此,笔者猜想:作为miRNA海绵的circRNA也可能通过阻断miRNA对其靶基因的抑制作用来改变靶基因的表达水平,在转录后层面调控变应性疾病的免疫反应及炎症反应,从而调控气道炎症性疾病的发生和进展;另外,作为一种竞争性内源性核糖核酸(competing endogenous ribonucleic acid,ceRNA),circRNA还可能调节 miRNA选择性剪接的过程,即通过它们与亲本基因剪接的竞争作用促进亲本基因的转录[4],从而与气道变应性疾病相关联;同时,circRNA亦可能通过circRNA-miRNA-gene通路来调控信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)的表达水平。

为探究该猜想的科学性和正确性,连云港市第二人民医院实验室在COPD发病机理与防治等方面做了大量前期研究:通过文献调研发现circRNA-001988、circRNA-0000344和circRNA-0000284在肺癌患者中异常表达,并且能调控肺癌的发生发展进程,提示circRNA在肺相关疾病的发生发展中扮演着重要角色[4]。本研究基于文献调研和前期实验结果,通过Arraystar circRNA芯片筛选获得两组受试者血清样本中差异表达的circRNA,再利用qRT-PCR验证了获得的目标circRNA分子,探究了circRNA在COPD中的表达情况及其对疾病病程发展的影响,以期为COPD的临床诊断和预后判断提供参考性生物标志物。

临床资料和方法

一、一般资料

纳入标准:(1)符合中华医学会呼吸分会指南中COPD的诊断。(2)年龄≤90岁。排除标准:(1)限制性通气功能障碍患者。(2)伴有其他可影响肺功能结果的慢性系统性疾病及严重疾病的。(3)支气管舒张试验阳性的患者。(4)不能交流及不愿意配合的患者。共纳入2014年1月至2016年12月在连云港市第二人民医院医院呼吸科住院及门诊治疗的80例COPD患者和同期在该院健康体检人群30例为研究对象进行回顾性研究,其中男性 58 例,女性 52 例;年龄61～82岁,平均(70±6)岁。本研究获得连云港市第二人民医院医学伦理委员会的批准,所有参与的受试者均签署了知情同意书。

二、主要试剂和仪器

TRIzol试剂(重庆普立科生物技术有限公司);异丙醇(江苏省宜兴市华生化工有限 公司);Arraystar Super RNA Labeling Kit(阿瑞星超级RNA)标记试剂盒(上海康成生物工程有限公司)。基因芯片扫描仪(安捷伦公司,G2505C);焦碳酸二乙酯 (上海研生生化试剂有限公司)。

三、方法

(一)诊断与分级标准

1.诊断标准:根据中华医学会呼吸病学分会制定的COPD诊断和治疗指南[6]对患者进行临床诊断。即吸入支气管舒张剂后,1 s用力呼气容积占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC%)<70%。

2.分级标准:根据吸入支气管舒张剂后,FEV1占预计值百分比下降的程度进行气流受限严重程度肺功能分级。(1)Ⅰ级(轻度):FEV1占预计值百分比≥80% 。(2)Ⅱ级(中度):50%≤FEV1占预计值百分比<80% 。(3)Ⅲ级(重度):30%≤FEV1占预计值百分比<50% 。(4)Ⅳ级(极重度):FEV1占预计值百分比<30%,合并慢性呼吸衰竭。

(二)一般资料获取

对患者的年龄、性别、病程等一般资料进行记录。对照组记录年龄、性别等资料。

(三)circRNA提取

1.样本的收集:采集所有研究对象早晨空腹的静脉血3 mL,并编号记录,-80℃保存备用。

2.总核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)的提取:为了保证实验结果的严谨性和可靠性,减少操作环境污染带来的误差,标本提取在超净台完成,所有材料进行灭菌处理。(1)-80℃冰箱简单随机法随机选取3例COPD患者及3例正常对照组血液样本,置于2～8℃冰箱使之溶解,加入3倍体积红细胞裂解液,混匀后室温放置10 min,10 000 r/min离心1 min。彻底吸弃上清,收集白细胞沉淀。每100～200 μL血液收集的白细胞沉淀加入1 mL总RNA抽提试剂TRIzol。室温放置5 min,使样品充分裂解。4℃ 12 000 r/min离心10 min,取上清。(2)将上清转入1.5 mL EP管中,冰上静置5 min,加入0.2 mL三氯甲烷,剧烈震荡约10 s混合均匀后室温放置3 min,4℃ 12 000 r/min离心15 min。(3)将上清小心转入新的洁净1.5 mL EP管中,加入等体积异丙醇,轻轻震荡混匀,-20℃放置30 min,4℃ 12 000 r/min离心10 min,小心移弃上清液。(4)加入1 mL 75%乙醇混匀,4℃ 7 500 r/min离心5 min。再用无水乙醇洗涤,4℃ 12 000 r/min离心2 min后用移液器小心吸弃上清液EP管置于超净工作台风干5～10 min。(5)平均加入约20 μL焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水溶解、稀释总RNA,沉淀较少的可适量减量。(6)利用NanoDrop ND-1000对所提取的RNA的纯度和浓度进行测定。

3.circRNA 芯片检测:(1)先用核糖核酸酶R(ribonuclease R,RNase R)消化总RNA,去除线性RNA,富集circRNAs。(2)将富集后的circRNAs采用随机引物转录,扩增为荧光标记的互补核糖核酸(complementary ribonucleic acid,cRNA)探针。cRNAs 探针与阿瑞星人类circRNA 序列表达谱芯片(Arraystar Human circRNA Array)—(8×15 K)表达谱芯片上的寡核苷酸片段杂交,基因芯片扫描仪扫描,安捷伦数据提取软件(Agilent Feature Extraction Software)(Version 11.0.1.1)分析杂交结果。

4.定量即时聚合酶链锁反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)验证候选的circRNA:将剩余的77例COPD患者及27例正常对照者的血液样本利用TRIzol法提取总RNA后,两组分别取1.5 μg总RNA,按照试剂盒说明书操作进行逆转录为互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid,cDNA),体系如下(反应体系50 μL):进行目的基因的即时聚合酶链锁反应(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测:根据circRNA芯片的检测结果,在circRNA数据库“circBase”(http://circbase.mdc-berlin.de)中查找候选circRNA的序列,依据circRNA引物设计的原则设计候选circRNA的发散引物(divergent primer),送至康成生物公司进行合成。

RNA模板5 μL引物divergent5 μL缓冲液5×RT10 μL脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)10 mM2.5 μL逆转录酶2 μLDEPC-H2O25.5 μL

反应条件:30℃,10 min → 42℃,60 min → 95℃,10 min。合成的cDNA 4°C保存备用。

利用设计合成的引物,通过普通聚合酶链锁反应(polymerase chain reaction,PCR)摸索最佳退火温度,再利用RT-PCR试剂盒进行定量,实时定量PCR体系如下:反应体系20 μL：以β-actin为内参,对COPD患者及正常对照者血液样本中候选的circRNA进行定量。各个基因产物测序完全符合的作为阳性对照,用来排除假阴性。不加模板的反应体系作为阴性对照,用以排除基因组DNA的污染。

cDNA2 μL2×SYBR Green Mix10 μLForward Primer(10 μM)1 μLReverse Primer(10 μM)1 μLDEPC-H2O6 μL

反应条件:95 ℃,10 min → 95 ℃,20 s→最佳退火温度,30 s → 72 ℃,30 s。

5.目标circRNA的注释和功能预测:(1)circRNA-miRNA-gene network的绘制:利用在线分析工具Target Scan(http://www.targetscan.org/)和miRanda(http://www.microrna.org/),以目标circRNA的序列为seed序列,绘制circRNA-miRNA-gene网络。(2)circRNA-miRNA-mRNA interaction network:利用在线分析工具Cytoscape(http://www.cytoscape.org/),以目标circRNA为节点,绘制circRNA-miRNA-mRNA网络。网络中预测的目标circRNA功能利用GO和KEGG信号通路分析进行注释。

6.利用数据分析软件进一步分析COPD中目标circRNA与COPD诊断及预后的相关性研究

四、观察指标

circRNA-001988、circRNA-0000344和circRNA-0000284在COPD组和正常组血液中的表达情况。

五、统计学分析

结 果

circRNA-001988、circRNA-0000344和circRNA-0000284在COPD患者的血液样本中均异常表达:与对照组相比,circRNA-001988和circRNA-0000344在COPD组中分别下调了(6.54±2.75)倍和(5.94±2.89)倍,见图1～2。circRNA-0000284在COPD组中则上调了(8.54±3.25)倍,见图3。差异均有统计学意义(P<0.05)。

讨 论

目前,COPD仍然是一项全球性的公共健康问题。在美国,COPD位居慢性致死致残性疾病第4位。另据一项由WHO和World Bank联合发布的研究推断,到2020年COPD所带来的社会负担将跃居全球疾病负担的第5位。在我国,尤其是我国农村地区,COPD的发病率较高,2018年新发布的我国COPD流行病学调查结果显示:40岁以上人群的COPD发病率高达13.7%;老年COPD患者急性加重期的病情较重,发病率也较高,这主要是因为老年患者通常合并较多基础疾病,且多系统疾病极易累积呼吸系统,从而造成老年COPD患者的发病率呈增长趋势,该人群COPD发病率已从2000年的11.33%上升至2010年的17.21%[4],这个情况应引起高度重视。因此,早发现早治疗对COPD患者的预后十分重要。由于COPD严重威胁着人类的健康,但在疾病的早期仅表现为生物化学和细胞水平事件,且无明显临床症状,诊断比较困难,因此寻找新的、有效的分子标志物和治疗靶点对于COPD的诊断和治疗具有重要的意义。DNA元素百科全书(encyclopedia of dna elements,ENCODE)项目证实:90%的基因组是被转录的[7],但仅有2%的转录体被用于编码蛋白,其余的都是ncRNA,包括miRNA(<200 ns)、circRNA、长链非编码核糖核酸(long non-coding ribonucleic acid,lncRNA)等。这些ncRNA在大多数物种的基因组中高度保守,可以影响多种生物过程,包括肿瘤、心血管疾病及肺疾病的发生和发展。一些研究已经证实,许多疾病有其特有和差异表达的ncRNA,可以作为多种人类疾病的诊断和预后预测分子标志物,这对疾病的早期诊断和预后判断具有重要意义[8]。近年来,这些ncRNA以其多样性、高效性、特异性、多靶点的调控特点,成为一种多层次、多途径的疾病治疗新策略研究的热点。

图1 circRNA-001988 在COPD组和健康对照组中的表达(*P≦0.01)

图2 circRNA-0000344 在COPD组和健康对照组中的表达(*P≦0.01)

图3 circRNA-0000284 在COPD组和健康对照组中的表达(*P≦0.01)

miRNA作为ncRNA中的一种,在多种疾病中的作用被广泛研究,在COPD中的研究也逐渐增加。Akbas等[9]利用qRT-PCR发现了5种miRNA在COPD患者血清中差异表达:miR-20a、miR-28-3p、miR-34c-5p、miR-100较正常组下调;miR-7则上调,并且miR-7的上调与COPD显著有关,提示miR-7可能可以作为COPD诊断的潜在分子标志物。Soeda等[10]研究发现:血浆中循环miR-106b在COPD患者中的表达水平明显低于健康对照组,且miR-106b的表达水平与COPD发生发展密切相关。Leidinger等[11]在研究中比较了肺癌组、COPD组、健康对照组的外周血中miRNA的表达情况:与健康对照组相比,肺癌组与COPD组的miRNA表达变化更相似;并且借助miRNA的表达结果分析能够以90.4%的准确率、89.2%的特异性和91.7%的灵敏度区分肺癌患者和COPD患者。总体而言,通过这研究结果可以肯定,血液中miRNA的变化特征可用于鉴别诊断COPD与肺癌。目前,越来越多文献报道miRNA在COPD中异常表达,并与COPD的发生发展具有一定的相关性[12]。且miRNA表达是具有时效性的,呈现动态表达变化,这可以间接反映在细胞内信号通路和微环境的变化。所以将miRNA作为COPD的生物标志物或是COPD治疗靶点是非常有潜力的。

但是另一种ncRNA——circRNA在COPD中的研究就相对较少。circRNA是近年来肿瘤研究领域的明星分子之一,它最早被发现于上世纪70年代的RNA病毒中,也属于ncRNA家族成员。与线性RNA不同,circRNA没有5′帽子,也没有3′尾巴,而是一种共价闭合的单股环状分子。circRNA主要来源于蛋白编码基因的外显子,也可由内含子、基因间区、UTR区、非编码RNA位点和已知转录物的反义位点产生,见图4。circRNA具有高度保守、稳定性强、特异性高、含量相对丰富的特点,可以作为miRNA海绵或ceRNA调控靶miRNA的活性,并参与基因转录和蛋白生成的调控,见图5。

图4 环状RNA生物合成模型

图5 三个调节亲本基因表达的环状RNA模型

circRNA参与多种疾病的发生发展,如动脉粥样硬化性血管疾病、神经系统疾病、朊病毒疾病与癌症等,在结直肠癌与胰腺导管腺癌中异常表达[13]。研究证实:CDR1as在脑中高表达,有超过60个miR-7的结合位点,同时miR-7被证实既可以作为原癌基因,又可以作为抑癌基因,在多种信号通路和疾病中发挥作用,是α-突触核蛋白和泛素结合酶E2A(ubiquitin conjugating enzyme E2A,UBE2A)的直接调控者,CDR1as与帕金森综合征、阿尔兹海默症以及脑的发育相关。因此,CDR1as/miR-7在癌症的发生发展中发挥着重要的作用。Wang等[4]研究发现:心脏相关的circRNA(HRCR)可作为miR-223的吸附体,抑制心脏肥大和心力衰竭。此外,在果蝇中,circRNA被证实是衰老的生物标志物;在人类唾液中的circRNA也可作为潜在的疾病相关的标志物[14-15]。近期研究证实在外泌体中亦存在丰富的circRNA,可以作为某些疾病诊断的分子标志物[16]。Ng等[17]研究显示:脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的circRNA-mcircRasGEF1B可以通过TLR4/NF-κB 信号通路正性调控ICAM-1 mRNAs的表达,敲除mcircRasGEF1B能降低LPS诱导的ICAM-1基因转录和蛋白表达水平,从而影响炎症反应过程。Wan等[18]对LPS诱导的急性呼吸窘迫综合征大鼠肺组织中circRNAs的表达谱进行微阵列分析,发现有957个circRNAs在大鼠肺组织中有差异性表达。由此可见,circRNA参与多种疾病的发生和发展,其与miRNA 的相互作用对于相关疾病的发病机制研究具有重要意义。

本实验室以连云港市第二人民医院为依托,在COPD发病机理及防治等方面做了大量的研究工作,并发表了相关文章。通过文献调研发现circRNA-001988,circRNA-0000344和circRNA-0000284在肺癌中异常表达,并且能调控肺癌的发生发展,提示circRNA在肺相关疾病的发生发展中扮演着重要角色,但是circRNA在COPD中的研究甚少。本项目收集在连云港市第二人民医院住院和门诊就诊的80例COPD患者及同期在该院进行健康体检的30例对照组为研究对象,通过Arraystar circRNA芯片筛选获得两组受试者血液样本中差异表达的circRNA为circRNA-001988、circRNA-0000344和circRNA-0000284。再利用qRT-PCR验证了获得的目标circRNA分子,并结合生物信息学软件对其进行注释和功能预测。结果显示:与正常组相比,circRNA-001988、circRNA-0000344在COPD组中分别下调了(6.54±2.75)倍和(5.94±2.89)倍,circRNA-0000284则在COPD组中上调了(8.54±3.25)倍。因此,circRNA可作为COPD的诊断和预后判断生物标志物,本研究结果为进一步阐释circRNA在COPD发生发展中的作用和机制奠定了基础。