乙醇对斑马鱼胚胎发育的急性毒害效应

2019-11-07李爱君张玉茹夏雪梅王彬容王维香

西华大学学报（自然科学版） 2019年6期

李爱君，张玉茹，夏雪梅，王彬容，王维香

(西华大学食品与生物工程学院，四川成都 610039)

乙醇(Ethanol)是一种有机化合物，俗称酒精。酒精可以给人体带来快感，所以酒精类饮品深受人们喜爱；但是过度饮酒会引起酒精中毒，酒精依赖，还可引发酒精相关的意外伤害、胰腺炎和胎儿酒精综合征等疾病[1-2]。有证据表明，在大量饮酒者中，癌症的发病率增高是由酒精的毒性所引起的。酒精可促进癌细胞生长。酒精可以成为溶剂，帮助致癌物渗入细胞膜。酒精还可通过损害肝细胞而降低肝脏的解毒力，使肝脏无法消除或灭活致癌物。大量饮酒受试者(每天大于3次)相比于不饮酒的人更易罹患5种癌症：上消化道/呼吸道癌症、肺癌、女性乳腺癌、结直肠肿瘤及黑色素瘤，而轻中度饮酒受试者更易患除肺癌外的其余4种肿瘤[3]。乙醇也是常见的致畸源，妊娠期间摄入乙醇对胚胎发育有严重影响，胎儿酒精综合征是最主要的发育畸形，表现为头面部畸形、发育迟缓、心血管发育障碍和中枢神经系统畸形等，这部分患儿给家庭和社会带来了很大的负担[4-5]。

斑马鱼(Daniorerio)是原产于印度河流的热带淡水鱼，目前已成为世界排名第三的受科研工作者重视的模式生物，被广泛应用于发育、药物筛选、毒理等方面研究。斑马鱼作为模式生物的优势很突出，具有胚胎体外授精发育，胚体透明，产卵量大，操作简单，可重复性，成本低，便于管理等优点，并且和人类基因有着87%的高度同源性，这意味着其实验结果大多数情况下适用于人体[6]。

为深入了解乙醇对胚胎发育的影响，本文研究了不同质量分数的乙醇对斑马鱼胚胎的致死率、孵化率、致畸率以及心包大小、心跳强弱等的影响作用，对乙醇的毒害作用进行初步评估，为乙醇对人体胚胎毒害的相关研究提供参考基础，同时也为以斑马鱼为模型研究乙醇毒害提供依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

体形正常，鱼鳞和鱼鳍无破损，游动灵活，捕食敏捷的野生型斑马鱼雌雄成鱼。

1.1.2 实验试剂

95%乙醇，分析纯。

1.1.3 实验仪器

中科海斑马鱼养殖系统(青岛中科海海水处理有限公司)，BCD-176DA型海尔冷藏冰箱(青岛海尔股份有限公司)，恒温培养箱(CB1350，上海皓庄仪器有限公司)，SZX10型OLYMPUS显微镜(日本奥林巴斯株式会社)Scope视屏成像系统，JA2003型电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，BSA224S-CW型千分之一电子称量天平(赛多利科学仪器(北京)有限公司)，六孔板。

1.2 方法

胚胎培养液的配制：分别称量NaCl 3.5 g、KCl 0.05 g、NaHCO30.025 g、CaCl20.1 g，用少量纯净水溶解，再用纯净水定容至1 L。

1.2.1 处理液的配制

用95%乙醇配制10 mL质量分数分别为0.5%、1%、1.3%、1.5%、2%的乙醇，对照组采取胚胎培养液来培养。

1.2.2 实验步骤

1.2.2.1 斑马鱼饲养

用中科海斑马鱼养殖系统养殖，保证每日14 h的光照，养殖水为至少曝气3 d，紫外线照射杀菌，并增氧的循环水，水温控制在(28±1)℃。成年斑马鱼每日喂食2次适合热带鱼的营养饲料小薄片及丰年虾，喂养后及时清理缸中的粪便。

1.2.2.2 收集胚胎

实验前一天20:00按2:1的比例选取健康的性成熟活泼斑马鱼的雄鱼和雌鱼放入盛有养殖水的交配盒中，用隔板隔开，进行遮光处理。实验当天8:00将隔板拿开，雌雄鱼追逐开始产卵，并记录产卵时间。30 min后将鱼卵挑出并清洗干净，使其无异物附着，显微镜下检查是否有不合格的胚胎，即观察胚胎是否分裂均匀或死亡。

1.2.2.3 乙醇处理

将2 hpf胚胎在显微镜下观察，选择表面光滑、分裂均匀的胚胎放入6孔板中，每孔20只胚胎，处理液5 mL，观察胚胎暴露至96 hpf的发育情况，重复3次。每隔24 h更换新鲜处理液，同时挑出死胎。

1.2.2.4 观察记录

分别在24、48、72、96 hpf观察记录胚胎死亡情况，在48、72、96 hpf记录胚胎孵化情况以及在72 hpf记录胚胎的畸形率；在各处理组中随机挑取5个个体来进行测量记录各暴露阶段斑马鱼测量指标：48、72 hpf胚胎20 s的心跳次数，72、96 hpf胚胎的体长，72 hpf胚胎的心包面积以及96 hpf胚胎眼睛背面长度。

1.2.2.5 斑马鱼胚胎细胞死亡荧光染色

将72 hpf的孵化仔鱼用5 mg/L吖啶橙溶液在28.5 ℃恒温避光染色30 min，染色结束后用胚胎培养液漂洗3次，每次漂洗5 min，直到染色剂漂洗干净，用0.05%麻醉剂麻醉1～3 min，用荧光显微镜观察斑马鱼暴露后的细胞凋亡情况，并用ImageJ测定荧光强度。

1.3 数据统计分析

用改良寇式法[7]计算72 h时的EC50(受试动物半数产生效应变化的浓度)、96 h时的LC50(受试动物半数死亡的浓度)以及IC50(受试动物半数被抑制孵化的浓度)。用Excel单因素方差分析进行处理组与对照组间的显著性差异分析，*P<0.05，**P<0.01。用ImageJ软件处理荧光图片后可直接得出Area和Intden，平均密度=Intden/Area，以CK为相对值100，换算出不同浓度的处理图片的相对荧光强度。

2 结果与分析

2.1 乙醇对斑马鱼胚胎发育的孵化、致死和致畸毒性效应

2.1.1 乙醇对斑马鱼胚胎孵化率的影响

由图1和图2(A)可知，对照组在48 hpf时斑马鱼胚胎开始孵化，72 hpf内全部孵化，而处理组在48 hpf并未开始孵化，从96 hpf不同处理组的孵化率可以看出随乙醇体积分数增大，孵化率下降，胚胎的颜色加深，并呈剂量效应，表明乙醇对斑马鱼胚胎孵化有抑制作用。96 hpf时对照、0.5%、1%、1.3%、1.5%和2%乙醇处理的胚胎孵化率分别为100%、100%、100%、100%、90%和15%；计算乙醇对胚胎96 h-IC50为1.56%(1.35%～1.80%，95%限制范围)。

2.1.2 乙醇对斑马鱼胚胎的致死效应

与对照组相比，随中毒时间延长，乙醇处理组斑马鱼胚胎随处理浓度增加死亡率上升，呈剂量效应(图2(B))。96 hpf时对照组、0.5%、1%、1.3%、1.5%和2%乙醇处理的胚胎死亡率分别为15%、15%、20%、25%、30%和65%；计算乙醇对斑马鱼胚胎的96 h-LC50为1.22%(0.91%～1.63%，95%限制范围)。

2.1.3 乙醇对斑马鱼胚胎的致畸率影响

图1(E)显示乙醇处理后的斑马鱼胚胎出现心包水肿、尾部打结、卵黄淤血、脊柱弯曲及不孵化，在显微镜中还观察到因水肿，斑马鱼胚胎无法保持平衡，且各种表型上的畸形情况随乙醇体积分数增加而愈加显著。从图2(C)得知乙醇对斑马鱼胚胎发育的致畸率随乙醇体积分数的增加而上升。72 hpf时对照组、0.5%、1%、1.3%、1.5%和2%乙醇处理的斑马鱼胚胎致畸率分别为5%、35%、70%、75%、80%和100%；计算乙醇对斑马鱼胚胎的72 h-EC50为1.01%(0.77%～1.32%，95%限制范围)。

图1 乙醇对斑马鱼胚胎形态发育的影响(A：24hpf；B：48hpf；C：72hpf；D：96hpf；E：96hpf致畸部位)

2.2 乙醇对斑马鱼胚胎体长发育、眼睛发育和心脏发育的影响

2.2.1 乙醇对斑马鱼胚胎体长发育的影响

72和96 hpf测量斑马鱼孵化仔鱼体长时，2%处理组胚胎未孵化或尾部弯曲严重导致无法测量。图3(A)表明，斑马鱼仔鱼体长随乙醇体积分数增加而变短，且在实验中发现有很多胚胎因乙醇作用而未完全孵化或造成尾部弯曲打结，该致畸作用随处理液浓度的增大而更加显著。乙醇体积分数达到1.3%时，乙醇对斑马鱼体长抑制作用显著。

2.2.2 乙醇对斑马鱼胚胎眼睛发育的影响

测量96 hpf斑马鱼眼睛直径时，因2%处理组胚胎呈未孵化状态，无法测量；从图3(B)可以看出，与对照组相比，处理组斑马鱼眼睛直径更短，并且该致畸作用呈剂量效应。乙醇体积分数达到1.3%时，乙醇对斑马鱼眼睛直径抑制作用明显。

图2 乙醇对斑马鱼胚胎孵化率(A)、死亡率(B)及72hpf畸形率(C)的影响

2.2.3 乙醇对斑马鱼胚胎心脏发育的影响

48 hpf时即观察到体积分数超过1.3%的乙醇斑马鱼处理组心跳缓慢且微弱无力。测量48和72 hpf斑马鱼胚胎心跳次数，结果见图3(C)。由图3(C)可知，斑马鱼胚胎20 s心跳次数随乙醇体积分数升高而减少，并呈剂量关系。48 hpf乙醇体积分数1.3%时，斑马鱼心跳与对照组相比，心跳缓慢现象明显；而72 hpf时乙醇体积分数达到1%，斑马鱼心跳与对照相比已缓慢显著。斑马鱼心跳次数与乙醇体积分数和处理时间均成剂量关系。测量72 hpf时斑马鱼胚胎心包面积(图3(D))发现，与对照组相比，经乙醇处理的斑马鱼胚胎心包面积明显增大，且呈剂量关系。在乙醇体积分数达到0.5%时，斑马鱼心包面积与对照组已有显著差异。乙醇对胚胎心血管系统的致畸作用在许多脊椎动物中都有发现[8]。钱林溪等[9]研究发现斑马鱼胚胎循环系统对乙醇暴露非常敏感，随着乙醇体积分数的升高，不完整的循环系统等畸形率也逐渐升高，与本研究结果类似。