高大维，张 凤，陈智超，常宏伟，张丽梅，陈蓓蕾，段 然

小肠结肠炎耶尔森菌在自然界广泛存在，是一种重要的食源性病原菌[1]，由于在寒冷的条件下生存的特性，使其在冰箱和冷冻冷藏食品中常常被发现[2]。该菌可引起感染者腹泻等肠道炎症，严重的可引起反应性关节炎等自身免疫性疾病。随着对该菌的不断研究，引起越来越多国内外学者的关注[3-4]。我中心作为该菌的国家监测点，自2005年以来，每年都对腹泻患者、动物宿主、冷冻冷藏食品等样本做了大量检测和研究，现将本年度采集样本的小肠结肠炎耶尔森菌检测的结果和分布分型特征报告如下。

1 材料与方法

1.1材料 2018年4-11月采集六安市城南镇和城北乡2个监测点的腹泻患者、动物宿主的粪便、苍蝇以及检测阳性患者对照样本，以及本市两大超市的冷冻冷藏食品，将采集样本按1∶10的比例置改良磷酸盐缓冲液(后称“改良PBS”)中冷藏(2～6 ℃)保存并及时(7～14 d)送检。

1.2试剂与仪器 改良PBS、CIN选择性培养基和动力-吲哚-尿素培养基(MIU)：青岛海博生物技术有限公司产品；半固体培养基：北京陆桥技术有限公司产品；分型血清试剂盒：日本生研株式会社产品，批号：286036；API20E生化鉴定条购：法国生物梅里埃公司产品，批号：1006634840；基因组DNA 提取试剂盒和PCR 反应体系试剂：天根生化科技有限公司产品；按参考文献[5]合成ail、ystA、ystB、yadA、rfbC、virF6种毒力基因的引物，由上海生工生物工程有限公司合成 ； PCR 扩增体系:参照使用说明书(采用每个体反应体系20 μL，每个体系加入纯水8 μL，PremixTaqVersion2.0(Loading dye mix )10 μL，上下引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL)；premix Taq酶试剂盒大连宝生物公司生产；限制性内切酶NotⅠ、XbaⅠ购自Promega公司，SeaKem Gold琼脂糖购自Cambraex Bio Seienee Roekland公司，蛋白酶K购自Merkc公司。以上使用的试剂均在有效期内。脉冲场凝胶电泳仪为Bio-Rad CHEF-DRⅢ系统和Bio-Rad CHEF-Mapper系统，凝胶成像仪为Bio-Rad GelDoc 2000系统，均为美国伯乐公司产品。

1.3方法 参照中国疾病预防控制中心编写的《小肠结肠炎耶尔森菌实验室分离与鉴定手册》 (2、3版)[5-6]程序。

1.4数据统计处理 用统计学软件SPSS21.0版本进行统计学处理，采用卡方检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。用BioNumerics 5.0软件对PFGE结果进行聚类分析。

2 结 果

2.1小肠结肠炎耶尔森菌的各类样本的分布 2018年共采集腹泻患者、家禽家畜、苍蝇、冷冻冷藏食品和病例对照各类样本617份，检出小肠结肠炎耶尔森菌38株，总的检出率为6.16%，11种样本中有7种检出该菌，猪的粪便检出率最高为25%，与总检出率相比差异有统计学意义(χ2=28.20，P<0.01)；其次为阳性病例对照样本，检出率为11.76%；鸡和狗的检出率均为8.33%(表1)。

表1 2018年六安市家各类样本小肠结肠炎耶尔森菌检出率
Tab.1 Detection Rate of Y.enterocolitica in Lu′an City in 2018

样品名称检测份数确定菌株数检出率(%)腹泻患者粪便27182.95鹅粪300鸡粪6058.33鸭粪2100猪粪641625狗粪1218.33牛粪200苍蝇6011.67阳性患者对照17211.76生食7356.85熟食3400合计617386.16

2.2 小肠结肠炎耶尔森菌的菌型分布

2.2.1血清型的检测情况 2018年分离38株小肠结肠炎耶尔森菌的血清型进行O∶1/O∶2、O∶3、O∶5、O∶8、 O∶9和 O∶3分型研究，其中O∶8型(14株)和O∶3型(17株)为本市的优势菌株，与往年类似[7-8]，分别占全市分离菌株数的36.84%和44.7%，成为该地该病的主要感染菌型，O∶5和O∶9型各分离出1株，有3株菌为未分型的其它血清型(表2)。

2.2.2毒力基因的检测情况 根据小肠结肠炎耶尔森菌毒力基因(ail、ystA、ystB、yadA、virF)的携带情况，对38株小肠结肠炎耶尔森菌进行4种基因型[9]分型研究，其中致病性的基因型III型和IV型，分别占总菌株的42.11%(16/38)和2.63%(1/38)，猪粪均为致病性的基因型III和IV型，其余样本均为非致病性基因型I型、II型(表3)。

2.2.3生化反应模式情况 我们通过法国生物梅里埃公司的API.20E生化试验系统对38株小肠结肠炎耶尔森菌进行生化学的鉴定，呈9种生化反应编码模式，最常见的3种生化反应编码式为：1155723、1015523、1155523三种，分别占鉴定菌株的39.47%、18.42%和15.79%，其它6种均不多见(表4)。结果显示生化反应编码模式与菌株的致病性和血清型别有关，其中菌株生化反应编码为1155723、1015523、1115523和1054523的均为致病性O∶3血清型。二生化反应编码1155723和1155523均为非致病性O8型菌株。O∶1/O∶2血清型的生化反应编码均为1154723。

表2 2018年不同类型样本小肠结肠炎耶尔森菌血清分布
Tab.2 Serum distribution ofY.enterocoliticain different types of samples in 2018

宿主血清型O1/O2O∶3O∶5O∶8O∶9未分型合计病人0008008猪016000016鸡2003005狗0001001苍蝇0010001食品0002125病例对照0100012合计2171141338

表3 2018年不同类型样本小肠结肠炎耶尔森菌独立基因携带情况
Tab.3 Independent gene carriers ofY.enterocoliticafrom different types of samples in 2018

样品类别基因型ⅠⅡⅢⅣ合计病人粪便18009猪粪0011516鸡粪31004狗粪01001苍蝇01001冷冻冷藏食品05005病例对照10012合计51611638

注：基因型Ⅰ型(ail-、ystA-、ystB-、yadA-、virF-)，Ⅱ型(ail-、ystA-、ystB+、yadA-、virF-)，Ⅲ型(ail+、ystA+、ystB-、yadA-、virF-)，Ⅳ型(ail+、ystA+、ystB-、yadA+、virF+)

表4 38株小肠结肠炎耶尔森菌生化反应模式与血清型比较
Tab.4 Thirty-eight strains ofY.enterocolitica: comparison of biochemical reaction patterns and serotypes

菌株生化型菌株血清型O∶3O∶8O∶1/O∶2O∶5未定型合计1014522300003101552370000711155236000061054523100001115472300200211555230100011155723090151511557430000111155763000022合计171021838

2.3本省首次在小肠结肠炎耶尔森菌患者家庭环境和动物宿主中检测到小肠结肠炎耶尔森菌 自2016年起，我中心在全省首次对腹泻病人粪便检测阳性的家庭设立阳性对照，对阳性病人家庭环境和饲养的家畜进行采样检测，今年首次在小肠结肠炎耶尔森菌阳性腹泻病人(样本编号为：AH2018-110400号)家的冰箱中检测到小肠结肠炎耶尔森菌(样本编号为：AH2018-110401号)，同时在另一个小肠结肠炎耶尔森菌阳性腹泻病人(样本编号为：AH2018-107200号)家饲养的家猪的粪便中(样本编号为：AH2018-107204号)检测到小肠结肠炎耶尔森菌。成为本省关于小肠结肠炎耶尔森菌患者家庭环境和饲养的家畜检出小肠结肠炎耶尔森菌的首次报告。

2.4脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型 应用PFGE的方法对2018年18株小肠结肠炎耶尔森菌进行基因组带型分型，结果显示，5份均携带毒力基因的猪粪样本分离菌株的带型类聚图高度一致， 5份腹泻病人分离菌株也均高度一致，均与本地鸡粪狗粪和食品等样本中分离菌株的带型类聚图还存在一定差异，腹泻病人粪便检测阳性的菌株和设立家庭阳性对照菌株的带型也存在一定的差异(图1)。

图1 18株小肠结肠炎耶尔森菌PFGE带型类聚图Fig.1 PFGE band pattern of 18 strains of Y.enterocolitica

3 讨 论

六安市地处安徽省西部简称皖西，是鄂豫皖三省交界的地区，对本市小肠结肠炎耶尔森菌的分布研究有着十分重要的意义。我中心自2005年以来一直对腹泻患者、动物宿主和冷冻冷藏食品等样本做了大量检测，基本弄清了该菌在腹泻患者、动物宿主和冷冻冷藏食品的分布情况。

2018年，我中心共采集11类617份样本，有9类38个样品检出小肠结肠炎耶尔森菌，总的检出率为5.30%。从检出率上看，64份猪粪样本中检出16份，检出率最高为25%，与总检出率相比差异有统计学意义(χ2=28.20，P<0.01)，且均为致病性菌株，我们应该高度重视，提示从事生猪饲养和屠宰人员在工作中做好防护，同时由于小肠结肠炎耶尔森菌可能以猪为“圆心”向四周发散分布[10]，我们也要做好猪的饲养和加工与周围消毒隔离工作，防止进一步扩散。腹泻患者、家禽家畜、苍蝇、冷冻冷藏食品和病例对照均检出小肠结肠炎耶尔森菌，阳性检出率也处于较低的水平。其中冷冻冷藏食品中生食的检测率低于往年[8-11]。综上，猪为致病性小肠结肠炎耶尔森菌的主要储存宿主，而其他家禽家畜和腹泻病人为非致病性小肠结肠炎耶尔森菌等主要携带者[12-13]。

对2018年分离小肠结肠炎耶尔森菌的血清型分型研究显示，其中O∶8型(14株)和O∶3型(17株)分别占全市分离菌株数的36.84%和44.74%，为本市的优势菌株，与往年类似[7-8]，成为本地区该病的主要感染菌型，致病性O∶3型菌种占比之高，应引起高度重视。毒力基因的检测情况，显示致病性的基因型III型和IV型，分别占比总菌株的42.11%(16/38)和2.63%(1/38)，且均从猪粪中检出，提示猪为本市致病性小肠结肠炎耶尔森菌菌的主要来源。其余各类样本均为非致病性基因型I型、II型，为低风险菌株。

通过对38株小肠结肠炎耶尔森菌进行生化学鉴定，呈9种生化反应编码模式，与血清型比较，发现API20E生化反应编码与血清学存在一定相关性[14]，其中菌株生化反应编码为1014522、1015523、1115523和1054523的均为致病性O∶3血清型。而生化反应编码1155723和1155523均为非致病性O8型菌株。O∶1/O∶2血清型的生化反应编码均为1154723。

2016年起，我中心首次在面向全省对腹泻病人粪便检测阳性的家庭设立阳性对照，对阳性病人家庭的环境和饲养的家畜进行采样检测，首次在小肠结肠炎耶尔森菌阳性腹泻病人家的饲养的家猪的粪便和冰箱中检测到小肠结肠炎耶尔森菌。成为本省关于小肠结肠炎耶尔森菌阳性病人家庭环境和饲养的家畜检出小肠结肠炎耶尔森菌的首次报告，对于弄清小肠结肠炎耶尔森菌的腹泻病人感染因素有较好的指导意义。通过PFGE方法对各类菌株样本的基因带型进行同源性比较的结果显示，腹泻病人粪便检测阳性的菌株和设立家庭阳性对照菌株的带型也存在一定的差异，提示患者家庭的冰箱内壁和饲养的家猪与患者的感染因素关系不大。但猪粪样本分离菌株的带型类聚图高度一致，腹泻病人分离菌株也均高度一致，均与本地鸡粪狗粪和食品等样本中分离菌株的带型类聚图还存在一定差异；提示猪之间的小肠结肠炎耶尔森菌高度同源[15]，人群之间的小肠结肠炎耶尔森菌也高度同源，与本地鸡粪狗粪和食品的同源性存在差异，此结果为不同种类小肠结肠炎耶尔森菌的防治提供科学的指导，需加强本地带菌猪群与健康猪群之间防护工作，同时做好小肠结肠炎耶尔森菌的腹泻病人与健康人群之间隔离防护工作。

(本文承中国疾控中心传染病所景怀琦研究员的帮助和指导，特此致谢。)

利益冲突：无